JoVE Encyclopedia of Experiments
التقنيات البيولوجية
0 مشاهدات • 4:31 د • July 8th, 2025
الميتوكان هي فئة من الأدوية التي تؤثر بشكل انتقائي على عمل الميتوكوندريا في الخلايا السرطانية وتحفز موت الخلايا المبرمج.
لتحديد السمية الخلوية الميتوكان ، قم بزرع معلق خلوي يحتوي على خلايا سرطانية شبه ملتصقة على صفيحة متعددة الآبار. عالج الطبق بمحلول الميتوكان المطلوب واحتضانه.
يدخل الميتوكان الخلية السرطانية لتعطيل نشاط الميتوكوندريا ، مما يؤدي في النهاية إلى موت الخلايا في الخلايا السرطانية الحساسة للميتوكان. عالج الخلايا بمحلول تلطيخ يحتوي على خليط من صبغة Hoechst ويوديد البروبيديوم.
Hoechst ، وهي صبغة فلورية منفذة للغشاء ، تخترق جميع الخلايا وترتبط بالمنطقة الغنية ب AT من الحمض النووي الخاص بها ، مما يضفي مضان أزرق على نوى الخلايا الحية والميتة.
في المقابل ، يدخل يوديد البروبيديوم ، وهو صبغة فلورية غير منفذة للغشاء ، الخلايا الميتة حصريا من خلال الأجزاء التالفة من أغشيةها. تتقاطع الصبغة بين قواعد الحمض النووي ، مما يضفي مضان أحمر إضافي على الخلايا الميتة. وجود كلتا الصبغتين في نوى هذه الخلايا يجعل الخلايا الميتة تبدو أرجوانية.
قم بالطرد المركزي للوحة بسرعة منخفضة لتسوية الخلايا لتحسين الدقة أثناء التصوير. صورة تحت المجهر الفلوري ، ولاحظ مجموعتين متميزتين من الخلايا. احسب عدد كلا النوعين من الخلايا.
تشيرالنسبة المئوية للخلايا الأرجوانية التي تمثل السكان الموتى مقارنة بإجمالي السكان إلى الإمكانات السامة للخلايا لاختبار ميتوكان.
ابدأ بإعداد محاليل المركبات ذات الأهمية بالتركيز المطلوب. تأكد دائما من خلط المركبات عن طريق الدوامة جيدا.
لقياس السمية الخلوية لمركب واحد ، قم بإعداد المركبات بتركيز نهائي 2X. في حالة قياس السمية الخلوية للتركيبات المركبة ، قم بإعدادها بتركيز نهائي 4X.
قم بإعداد أدوات التحكم بالمذيبات فقط عن طريق خلط نفس الكمية من المذيبات مع الوسط المناسب. اجمع الخلايا في أنبوب مخروطي سعة 15 مليلتر ، وقم بتجميع 10 ميكرولترات من تعليق الخلية لتلوين التريبان الأزرق. أضف 10 ميكرولترات من 0.4٪ تريبان بلو إلى الكمية ، واستخدم مقياس كثافة الدم أو عداد الخلايا لحساب الخلايا القابلة للحياة وغير القابلة للحياة.
خلايا الحبيبات في أنبوب 15 مليلتر عند 200 × جم لمدة 5 دقائق ، ثم شفط أو صب المادة الطافية. أعد تعليق حبيبات الخلية في وسائط مناسبة للفحص بكثافة خلية 3 × 105 خلايا لكل مليلتر. استخدم ماصة متعددة القنوات لزرع 50 ميكرولترا من معلق الخلايا في كل بئر من صفيحة سعة 96 بئرا.
بالنسبة لفحوصات المركب الفردي ، أضف 50 ميكرولترا من محلول مركب 2X في كل بئر. بالنسبة لآبار التحكم في المذيبات ، أضف 50 ميكرولترا من وسائط الاختبار التي تحتوي على المذيب بتركيز 2X. بالنسبة للمقايسات المركبة ، أضف 25 ميكرولترا من كل مركبة من مركبات 4X في كل بئر. بالنسبة لآبار التحكم في المركب الفردي ، أضف 25 ميكرولترا لكل من محلول مركب 4X ووسط الاختبار. تأكد من أن التركيز النهائي ل DMSO لا يتجاوز 0.5٪.
لضمان قابلية التكاثر ، أضف الأدوية مع طرف الماصة الذي يلامس جانب الآبار ، مع الحرص على إضافة الأدوية إلى مواقع مختلفة. يجب تنفيذ هذه الخطوة بسرعة كبيرة ، ويفضل ألا تستغرق أكثر من 30 دقيقة لكل طبق.
اضغط برفق على اللوحة لخلط محتويات الآبار ، واحتضانها عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون.
عندما تكون جاهزا لتلطيخ الخلايا باستخدام Hoechst 33342 ويوديد البروبيديوم ، قم بإعداد محلول تلطيخ جديد 10X ، وأضف 10 ميكرولتر إلى كل بئر. اضغط برفق على الطبق واحتضنه على حرارة 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة.
قمبالطرد المركزي للوحة عند 200 × جم لمدة 4 دقائق لإحضار جميع الخلايا إلى قاع اللوحة. بعد ذلك ، امسح الجزء السفلي من اللوحة بعناية بمنديل مبلل في المختبر لإزالة أي حطام قد يتداخل مع التصوير. صور اللوحة في غضون 15 دقيقة بعد الطرد المركزي.