مقايسة استنفاد الجلوكوز في المختبر: طريقة قائمة على التألق لتحديد كمية امتصاص الجلوكوز الخلوي عن طريق قياس استنفاد الجلوكوز خارج الخلية

يدخل الجلوكوز ، وهو مصدر أساسي للطاقة الخلوية ، إلى الخلايا عبر بروتينات ناقل الجلوكوز في غشاء الخلية. يتم تكسير الجلوكوز في سيتوبلازم الخلية للبيروفات ، عبر مسار تحلل السكر ، مما يولد الطاقة من خلال أدينوسين ثلاثي الفوسفات ، أو ATP ، لعملية التمثيل الغذائي الخلوي.

لقياس امتصاص الجلوكوز داخل الخلايا ، ابدأ بثقافة ملتصقة من الخلايا الليفية في صفيحة متعددة الآبار. استبدل الوسائط بوسائط خالية من الجلوكوز واحتضنها. تقوم الخلايا باستقلاب الجلوكوز المتاح لإنتاج الطاقة ، والوصول إلى حالة متعطشة للجلوكوز.

استبدل الوسائط الموجودة في مجموعة واحدة من الآبار بوسائط خالية من الجلوكوز تحتوي على الأنسولين ، ومحفز امتصاص الجلوكوز ، وديوكسي جلوكوز الفلورسنت ، وهو نظير للجلوكوز. عالج مجموعة أخرى من الآبار بوسائط خالية من الجلوكوز تحتوي على ديوكسي جلوكوز الفلورسنت.

أثناء الحضانة ، يحفز الأنسولين نقل ناقلات الجلوكوز الإضافية إلى غشاء البلازما ، مما يسهل زيادة امتصاص ديوكسي جلوكوز الفلورسنت ، في حالة عدم وجود الجلوكوز.

يتم فسفرة ديوكسي جلوكوز ولا يتم استقلابه بواسطة الخلايا. في الوقت نفسه ، ينخفض تركيز جلوكوز الديوكسي الفلوري خارج الخلية.

بعد الحضانة ، اجمع الوسائط التي تحتوي على ديوكسي جلوكوز الفلورسنت غير المستخدم. عالج الخلايا بمحلول تحلل. يشكل المنظف الموجود في المخزن المؤقت مذيلات ويذوب الأغشية الخلوية ، مما يتسبب في إطلاق المحتوى داخل الخلايا.

باستخدام قارئ صفيحة دقيقة ، قم بقياس تألق تجانس الخلية الذي يحتوي على ديوكسي جلوكوز الفلورسنت داخل الخلايا والوسائط التي تحتوي على ديوكسي جلوكوز الفلورسنت خارج الخلية غير المستخدمة.

تظهر الخلايا الليفية المحفزة بالأنسولين زيادة في امتصاص ديوكسي جلوكوز الفلورسنت داخل الخلايا وما يقابلها من انخفاض في ديوكسي جلوكوز الفلورسنت خارج الخلية مقارنة بالخلايا غير المحفزة.

استخدم 8 نسخ متماثلة لكل شرط محاكاة. لذلك ، قم بإعداد 1 مليلتر لكل حالة محاكاة.

استخدم 7 شروط محاكاة بدون الأنسولين: FD-glucose من 2.5 ميكروغرام لكل مليلتر ، 1 ميكروغرام لكل مليلتر ، 0.5 ميكروغرام لكل مليلتر ، 0.2 ميكروغرام لكل مليلتر ، 0.1 ميكروغرام لكل مليلتر ، 0.05 ميكروغرام لكل مليلتر ، و 0 ملليغرام لكل مليلتر في طبق واحد 96 بئر.

استخدم 7 شروط تحفيز مع الأنسولين: FD-glucose من 2.5 ميكروغرام لكل مليلتر ، 1 ميكروغرام لكل مليلتر ، 0.5 ميكروغرام لكل مليلتر ، 0.2 ميكروغرام لكل مليلتر ، 0.1 ميكروغرام لكل مليلتر ، 0.05 ميكروغرام لكل مليلتر ، و 0 ميكروغرام لكل مليلتر في لوحة أخرى 96 بئر.

لتحضير ظروف التحفيز ، قم بتخفيف 1 ميكرولتر من 5 ملليغرام لكل مليلتر من محلول عمل FD-glucose و 999 ميكرولتر من DMEM الخالي من الجلوكوز للحصول على 1 مليلتر من محلول المخزون العام.

باستخدام محلول مخزون العمل هذا ، قم بإعداد 1: 2000 ، 1: 5000 ، 1: 10000 ، 1: 25000 ، 1: 50000 ، و 1: 1: 100،000 من FD-glucose للحصول على 2.5 ميكروغرام لكل مليلتر ، 1 ميكروغرام لكل مليلتر ، 0.5 ميكروغرام لكل مليلتر ، 0.2 ميكروغرام لكل مليلتر ، 0.1 ميكروغرام لكل مليلتر ، 0.05 ميكروغرام لكل مليلتر في أنابيب 2 مليلتر مباشرة قبل التجارب في خزانة السلامة الحيوية بدون أضواء. أضف 1 ميكرولتر من الأنسولين إلى كل حالة من هذه الحالات.

بعد 40 دقيقة من الحضانة ، قم بصب DMEM الخالي من الجلوكوز من كل بئر في 96 بئرا ، وامتص السائل المتبقي باستخدام مناشف ورقية معقمة. أضف 100 ميكرولتر لكل من ظروف العلاج المختلفة الموضحة من قبل ، إلى الآبار على طول عمود واحد ، و 100 ميكرولتر من نفس حالة المعالجة إلى الآبار على طول الصف في كلتا اللوحتين المكونتين من 96 بئرا. قم بتسمية اللوحات التي استخدمت الظروف مع الأنسولين وبدونه.

أضف DMEM الخالي من الجلوكوز وحده إلى آبار التحكم. احتضن الطبق لمدة 40 دقيقة في حاضنة زراعة الخلايا في الظلام.

بعد تحفيز الخلايا لمدة 40 دقيقة ، انقل وسائط التحفيز من كلا اللوحين إلى ألواح جديدة مكونة من 96 بئرا ، مع الحفاظ على نفس التصميم التجريبي. اغسل الخلايا باستخدام PBS. قم بإزالة PBS وصب أي محلول متبقي على مناشف ورقية معقمة.

أضف مثبطا للبروتياز إلى المخزن المؤقت لمقايسة الترسيب المناعي المشع لحماية البروتينات. ضع الألواح التي تحتوي على اختبار الترسيب المناعي الإشعاعي في شاكر لمدة 30 دقيقة.

باستخدام قارئ صفيحة دقيقة ، قم بقياس التألق عند الأطوال الموجية للإثارة والانبعاث 485 و 535 نانومتر على التوالي ، أولا ، في الوسط الذي يحتوي على جلوكوز FD خارج الخلية ، ثم اللوحة ذات الخلايا المحللة بفحص الترسيب المناعي الإشعاعي في نهاية 30 دقيقة من الحضانة.