قياس الاستنفاد التناظري للجلوكوز الفلوري خارج الخلية: تقنية قياس بديلة لتقييم امتصاص الجلوكوز في أعضاء الفئران خارج الجسم الحي

في الأنسجة ، يدخل الجلوكوز خارج الخلية إلى الخلايا عن طريق الانتشار الميسر من خلال ناقلات الجلوكوز المحددة.

يتم تكسير الجلوكوز إلى بيروفات في سيتوبلازم الخلية عن طريق تحلل السكر ، وهو مسار استقلابي ، يولد الطاقة في شكل أدينوسين ثلاثي الفوسفات ، أو ATP ، لعمليات التمثيل الغذائي الخلوية.

لقياس امتصاص الجلوكوز من الجسم الحي، ابدأ بأنسجة كبد الفأر الصغيرة الحجم التي تم حصادها حديثا. أضف عازلة مناسبة للحفاظ على الظروف الفسيولوجية.

بعد ذلك ، انقل الأنسجة إلى صفيحة متعددة الآبار تحتوي على وسائط خالية من الجلوكوز. اتبعه عن طريق الحضانة في وسائط خالية من الجلوكوز مكملة ب deoxyglucose ، وهو نظير جلوكوز يحمل علامة الفلورسنت. يسمح الحجم الصغير للأنسجة بدخول ديوكسي جلوكوز.

يدخل ديوكسي جلوكوز إلى الخلايا من خلال ناقلات الجلوكوز ، في حالة عدم وجود الجلوكوز. داخل الخلايا ، يخضع ديوكسي جلوكوز للفسفرة ولكن لا يتم استقلابه أكثر ، مما يؤدي إلى تراكمه.

اجمع الوسائط التي تحتوي على ديوكسي جلوكوز غير مستخدم ومصنف بالفلورسنت في النقاط الزمنية المطلوبة. باستخدام قارئ صفيحة دقيقة ، قم بقياس تألق ديوكسي جلوكوز خارج الخلية ، والذي يمكن ربطه بامتصاص الأنسجة داخل الخلايا لديوكسي جلوكوز.

احتضان الأنسجة أو الأعضاء المحصودة في صفيحة من 6 آبار تحتوي على PBS لمدة دقيقة واحدة. تعامل مع كل نسيج أو عضو في بئر منفصل. بعد دقيقة واحدة ، ضع كل منديل على منشفة ورقية معقمة لامتصاص PBS.

انقل الأنسجة أو الأعضاء في صفيحة منفصلة مكونة من 6 آبار تحتوي على 4,000 ميكرولتر من DMEM الخالي من الجلوكوز ، واحتضانها لمدة دقيقتين. بعد دقيقتين ، قم بإزالة الأنسجة ونقلها إلى آبار من صفيحة مكونة من 6 آبار تحتوي على محلول عمل FD-glucose 0.29 مللي مولار. احتضان الألواح المكونة من 6 آبار التي تحتوي على أنسجة في محلول عمل FD-glucose عند 37 درجة مئوية.

اجمع 100 ميكرولتر من محلول عمل FD-glucose من كل بئر بعد 0 و 10 و 20 و 30 و 40 و 60 و 90 و 120 دقيقة من الحضانة ، ونقل 100 ميكرولتر من محلول عمل FD-glucose إلى ألواح 96 بئرا لتحليل حركية استنفاد الجلوكوز FD خارج الخلية. رج العبوة قبل الجمع وبعده.

قم بقياس التألق عند الأطوال الموجية للإثارة والانبعاث 485 و 535 نانومتر على التوالي باستخدام قارئ صفيحة دقيقة.