فحص الحركة المقلوبة: تقنية في المختبر لتصور حركة الميوسين على خيوط الأكتين المجمدة

الميوسين - بروتين حركي - له مجال رأس كروي يتفاعل مع الأكتين - وهو بروتين خيطي. هذا التفاعل ضروري لنقل الميوسين على طول خيوط الأكتين. لدراسة هذا الارتباط في المختبر ، قم بإجراء فحص الحركة المقلوب للميوسين فوق الأكتين المربوط على السطح.

للبدء ، قم بتجميع غرفة الفحص عن طريق وضع غطاء من البولي إيثيلين جلايكول الحيوي - PEG المطلي فوق شريحة مجهرية بحيث يواجه السطح المطلي الداخل ، مما يؤدي إلى إنشاء الجزء العلوي من الغرفة.

مرر محلول يحتوي على أفيدين - بروتين سكري - عبر الغرفة. يرتبط Avidin بالبيوتين مع تقارب عال ، مما يعزز التصاق الأكتين. بعد ذلك ، تتدفق في خيوط الأكتين الموسومة بالبيوتين المسمى بالفلوروفور الأحمر. يرتبط رابط البيوتين ب avidin ، مما يؤدي إلى تثبيت الخيوط الموجودة على سطح الغطاء.

أخيرا ، أضف بروتينات الميوسين 5A المسماة ببروتين الفلورسنت الأخضر في مخزن مؤقت يحتوي على جزيئات أدينوسين ثلاثي الفوسفات ، أو ATP. يتفاعل الميوسين ثنائي الرأس 5A ، الذي يحتوي على رأس زائدة ورأس رئيسي ، مع خيوط الأكتين المجلدة. يرتبط الرأس اللاحق للميوسين ب ATP وينفصل عن الأكتين.

يولد التحلل المائي ل ATP ضربة طاقة ، مما يمكن الرأس الخلفي من الارتباط بموضع أمام الرأس الأمامي على طول الفتيل. من خلال ضربات القوة المتتالية ، يتحرك الميوسين على طول خيوط الأكتين المجمدة دون انفصال.

باستخدام الفحص المجهري الفلوري ، سجل حركة جزيئات الميوسين الخضراء على خيوط الأكتين الحمراء.

قم بإعداد الحلول لمقايسة الحركة المقلوبة myosin 5a ، واحتفظ بها على الجليد.

اغسل الغرفة ب 10 ميكرولتر من عازلة الحركة باستخدام DTT. تدفق في 10 ميكرولتر من 1 ملليغرام لكل مليلتر BSA في المخزن المؤقت للحركة مع DTT. كرر هذا مرتين ، وانتظر دقيقة بعد الغسيل الثالث. استخدم المناديل الورقية أو ورق الترشيح لامتصاص المحلول عبر القناة عن طريق وضع زاوية الورق برفق عند مخرج حجرة التدفق.

ثم اغسل الغرفة ب 10 ميكرولتر من عازلة الحركة باستخدام DTT ثلاث مرات. تدفق في 10 ميكرولتر من محلول NeutrAvidin في عازلة الحركة مع DTT ، وانتظر لمدة دقيقة واحدة. ثم اغسل ب 10 ميكرولتر من هذا المحلول ثلاث مرات.

تدفق في 10 ميكرولتر من المخزن المؤقت للحركة المحتوي على bRh-actin باستخدام DTT باستخدام طرف ماصة كبير الملل ، وانتظر لمدة دقيقة واحدة. ثم اغسل ب 10 ميكرولتر من عازلة الحركة باستخدام DTT ثلاث مرات.

تدفق في 30 ميكرولترا من المخزن المؤقت النهائي مع 10 نانومولار ميوسين 5 أ ، وقم بتحميله على الفور على مجهر انعكاس الانعكاس الداخلي الكلي. ابدأ التسجيل بمجرد العثور على التركيز البؤري الأمثل لتصوير TIRF.