مقايسة قياس التدفق الخلوي لتحديد الإجهاد التأكسدي: اختبار لتحديد أنواع الأكسجين التفاعلية في العضيات المعوية باستخدام مجسات الفلورية

تنتج الخلايا المعوية أنواعا من الأكسجين التفاعلي - ROS. تحافظ مستويات ROS المعتدلة على التوازن الخلوي ، بينما يمكن أن تتسبب مستويات ROS المرتفعة في موت الخلايا.

لتحديد مستويات ROS في المختبر ، ابدأ بثقافة العضيات ثلاثية الأبعاد المعوية للفأر. تظهر هذه العضيات بنية ظهارة الأمعاء لها نتوءات تشبه القبو تؤوي خلايا جذعية خضراء تعبر عن التألق. كما أنها تحتوي على خلايا متمايزة تشبه الزغابات في المحيط ، وتحيط بالتجويف المركزي الذي يتكون من الخلايا الميتة والحطام. كل هذه الخلايا تنتج مستويات مختلفة من أنواع الأكسجين التفاعلية.

الآن ، عالج العضيات في الآبار المخصصة باستخدام معدلات ROS. بناء على طبيعتها ، يمكن أن تعمل المغيرات كمحفزات أو مثبطات ROS. بعد الحضانة للمدة المطلوبة ، قم بإزالة الوسط المستهلك.

أضف إنزيما محللا للبروتين إلى المزرعة ، مما يؤدي إلى تعطيل بنية العضيات ثلاثية الأبعاد وإطلاق خلايا مختلفة في حالة تعليق. بعد ذلك ، أضف مسبارا فلوروجينيا حساسا ل ROS واحتضنها.

عند دخول الخلايا ، تتفاعل المجسات مع ROS وتتأكسد لإنتاج مضان أحمر. عالج الخلايا باستخدام DAPI - صبغة فلورية مرتبطة بالحمض النووي - والتي تلطخ نوى الخلايا الميتة بشكل انتقائي - مما يخلق تباينا مع الخلايا الحية.

باستخدام مقياس التدفق الخلوي ، قم بتحليل الخلايا الحية السالبة DAPI للحصول على إشارة مضان حمراء تتوافق مع مستوى ROS الخاص بها. اعتمادا على طبيعة المغيرات ، تزيد المحرضات من مستويات ROS بينما تقللها المثبطات.

أضف 1 ميكرولتر من محلول مخزون N-acetyl cysteine في آبار التحكم السلبية للوحة القاع المستديرة المكونة من 96 بئر والتي تحتوي على العضيات.

بعد حضانة لمدة ساعة واحدة ، أضف 1 ميكرولتر من محلول مخزون هيدروبيروكسيد Tert-butyl في الآبار المقابلة ، واحتضنه لمدة 30 دقيقة. بعد ذلك، باستخدام ماصة متعددة القنوات، قم بإزالة الوسيط دون إزعاج BMM المرفق، وانقله إلى لوح آخر دائري القاع سعة 96 بئرا. اترك هذا الطبق جانبا.

بعد ذلك، أضف 100 ميكرولتر من التربسين، وباستخدام ماصة متعددة القنوات، قم بتحريك الماصة لأعلى ولأسفل خمس مرات لتدمير BMM. بعد حضانة قصيرة مدتها 5 دقائق ، قم بفصل العضيات عن طريق سحب العينة لأعلى ولأسفل مرة ثانية.

قم بتدوير اللوحة وتخلص من المادة الطافية عن طريق قلب اللوحة. أضف الوسط الذي تم جمعه مسبقا في صفيحة أخرى مكونة من 96 بئرا ، وأعد إلى الآبار المقابلة ، وأعد تعليق الخلايا عن طريق سحب العينات لأعلى ولأسفل خمس مرات.

بعد ذلك ، أضف 1 ميكرولتر من المسبار الفلوري ، واحتضنه لمدة 30 دقيقة. بعد ذلك ، قم بتدوير اللوحة مرة أخرى ، وأعد تعليق الخلايا ب 250 ميكرولتر من محلول DAPI. انقل العينات في أنابيب قياس التدفق الخلوي ، واحتفظ بالأنابيب على الجليد.

قم بتحسين إعدادات جهد التشتت الأمامي والجانبي على جهد التحكم والليزر غير الملوث، لكل فلوروفور باستخدام عينات أحادية الصبغة. بعد ذلك ، باستخدام استراتيجية بوابة مناسبة ، اجمع ما لا يقل عن 20,000 حدث.