فحص SUMOylation: تقنية في المختبر للكشف عن حالة SUMOylation لبروتينات الركيزة عن طريق النشاف المناعي

يحدث SUMOylation بسبب ارتباط المعدلات الصغيرة الشبيهة باليوبيكويتين ، SUMOs ، ببروتينات الركيزة.

SUMOylation عندما يتم تنشيط ببتيد سومو الناضج بواسطة إنزيم - E1. عند التنشيط ، يتم نقل SUMO إلى الموقع النشط للإنزيم المترافق - E2 - لربط SUMO ببقايا اللايسين لبروتين الركيزة. يعزز ليجاز آخر - E3 - كفاءة هذا التفاعل.

لإجراء اختبار SUMOylation في المختبر ، ابدأ بأنبوب يحتوي على خليط من بروتين الركيزة - p53 ، والإنزيمات ، وببتيدات SUMO ، واحتضن للحث على SUMOylation. استكمل الأنبوب بكبريتات دوديسيل الصوديوم - المخزن المؤقت المحتوي على SDS ، وإنهاء التفاعل. سخني العينة لتشويه طبيعة البروتينات.

قم بتحميل مزيج البروتين في بئر جل SDS-PAGE وقم بإجراء الرحلان الكهربائي. تتحرك البروتينات ذات الوزن الجزيئي الأعلى بشكل أبطأ من متغيراتها غير SUMOylated ، مما يولد شريطين متميزين.

انقل الجل إلى غشاء نشاف موجود على ورق ترشيح مبلل في جهاز نشاف كهربائي. قم بتغطيتها بورق ترشيح مبلل وانقل البروتينات كهربائيا من الجل إلى الغشاء.

عالج الغشاء بالأجسام المضادة ل p53 ، والتي ترتبط ب p53. تراكب مع الأجسام المضادة الثانوية المترافقة بالإنزيم التي ترتبط بمجمعات الأجسام المضادة-p53. أضف ركيزة كيميائية لتوليد منتج مضيء وتصوير الغشاء.

يتوافق نطاق الوزن الجزيئي الأعلى مع البروتينات SUMOylated ، بينما يتوافق النطاق السفلي مع متغيرات البروتين غير SUMOylated.

أضف 3 ميكرولتر من 100 نانوجرام لكل ميكرولتر من العلامة المنقاة-K-bZIP في تفاعل المزيج الرئيسي SUMOylation في المختبر. ثم اخلطي محتويات المزيج الرئيسي برفق ، واحتضنيه على حرارة 30 درجة مئوية لمدة 3 ساعات.

بعد ذلك ، أضف 20 ميكرولترا من 2x SDS-PAGE مع مخزن مؤقت للتحميل لإيقاف التفاعل. ثم قم بتسخين العينات على حرارة 95 درجة مئوية لمدة 5 دقائق لتشويه طبيعة البروتين.

بعد ذلك ، قم بتحميل 20 ميكرولترا من العينة على جل SDS-PAGE بنسبة 10٪ ، وقم بتشغيل الجل عند 80 فولت لمدة 120 دقيقة تقريبا حتى تصل الصبغة إلى قاع الجل.

بمجرد انتهاء الرحلان الكهربائي ، افصل جهاز الجل ، وانقل الجل في مخزن مؤقت للنقل شبه جاف لمدة 5 دقائق. ثم انقع غشاء PVDF في وعاء آخر مملوء بالميثانول لمدة 1 دقيقة.

قم بإزالة غشاء PVDF من الميثانول ، وانقعه في مخزن مؤقت للنقل شبه الجاف. ثم حرك الغشاء برفق لمدة 5 دقائق.

قم بإزالة غطاء الأمان للجهاز الكهربائي شبه الجاف. قم ببلل ورق الترشيح مسبقا ، وقم بإعداد شطيرة جل في قاع الأنود البلاتيني. بعد تثبيت لوحة الكاثود في غطاء الأمان ، قم بتشغيل اللطخة عند تيار ثابت 15 فولت لمدة 90 دقيقة. بعد ذلك ، قم بإيقاف تشغيل مصدر الطاقة وإخراج غشاء PVDF ، بعد فصل الجهاز شبه الجاف.

الآن ، قم بحظر غشاء PVDF بمخزن مؤقت مانع ، لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة على شاكر مداري بمعدل 30 دورة في الدقيقة. بعد ذلك ، قم بتهجين غشاء PVDF بجسم مضاد مضاد ل p53 وحجب المخزن المؤقت لمدة 12 إلى 16 ساعة عند 4 درجات مئوية ، على خلاط تعليق بسرعة 30 دورة في الدقيقة.

بعد ذلك ، أخرج غشاء PVDF ، وانقله في وعاء مملوء بمحلول ملحي مخزن TRIS مع Tween-20. بعد ذلك ، انقع غشاء PVDF في محلول ملحي مخزن ب TRIS مع Tween-20 لمدة 30 دقيقة على شاكر المداري بمعدل 45 دورة في الدقيقة. بعد ذلك ، قم بتهجين غشاء PVDF بجسم مضاد مضاد للأرانب مقترن ببيروكسيداز الفجل المخفف في مانع المخزن المؤقت ، لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة على خلاط التعليق عند 30 دورة في الدقيقة.

بعد ذلك ، اغسل غشاء PVDF بمحلول ملحي مخزن TRIS باستخدام Tween-20 ثلاث مرات. بعد الغسيل ، انقع غشاء PVDF في محلول ملحي مخزن مؤقتا من TRIS Tween-20 لمدة 30 دقيقة على خلاط التعليق بمعدل 45 دورة في الدقيقة. بعد ذلك ، استبدل المحلول الملحي Tween-20 المخزن مؤقتا بمحلول ملحي مخزن بالفوسفات للحفاظ على غشاء PVDF عند 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى 12 ساعة.

بعد ذلك ، امزج كواشف الركيزة الكيميائية المحسنة 1 و 2 بنسبة 1: 1. بعد ذلك ، قم بإزالة غشاء PVDF من المحلول الملحي المخزن بالفوسفات ، وامسح لفترة وجيزة بجيوب مثقوبة لامتصاص الرطوبة الزائدة.

على الفور ، أضف 400 ميكرولتر من الكاشف الكيميائي إلى سطح الغشاء ، وانتظر لمدة 3 إلى 5 دقائق. لطخة لفترة وجيزة لتصريف الكاشف الكيميائي الزائد ، مما يمنع الغشاء من الجفاف تماما. استخدم نظام التصوير التلألؤ لفضح اللطخة.