فحص SUMOylation: تقنية في المختبر للكشف عن حالة SUMOylation لبروتينات الركيزة عن طريق النشاف المناعي
موسوعة JoVE للتجارب
التقنيات البيولوجية
0 مشاهدة • 6:00 دقيقة • July 8th, 2025
يحدث SUMOylation بسبب ارتباط المعدلات الصغيرة الشبيهة باليوبيكويتين ، SUMOs ، ببروتينات الركيزة.
يحدثSUMOylation عندما يتم تنشيط ببتيد سومو الناضج بواسطة إنزيم - E1. عند التنشيط ، يتم نقل SUMO إلى الموقع النشط للإنزيم المترافق - E2 - لربط SUMO ببقايا اللايسين لبروتين الركيزة. يعزز ليجاز آخر - E3 - كفاءة هذا التفاعل.
لإجراء اختبار SUMOylation في المختبر ، ابدأ بأنبوب يحتوي على خليط من بروتين الركيزة - p53 ، والإنزيمات ، وببتيدات SUMO ، واحتضن للحث على SUMOylation. استكمل الأنبوب بكبريتات دوديسيل الصوديوم - المخزن المؤقت المحتوي على SDS ، وإنهاء التفاعل. سخني العينة لتشويه طبيعة البروتينات.
قم بتحميل مزيج البروتين في بئر جل SDS-PAGE وقم بإجراء الرحلان الكهربائي. تتحرك البروتينات ذات الوزن الجزيئي الأعلى بشكل أبطأ من متغيراتها غير SUMOylated ، مما يولد شريطين متميزين.
انقل الجل إلى غشاء نشاف موجود على ورق ترشيح مبلل في جهاز نشاف كهربائي. قم بتغطيتها بورق ترشيح مبلل وانقل البروتينات كهربائيا من الجل إلى الغشاء.
عالج الغشاء بالأجسام المضادة ل p53 ، والتي ترتبط ب p53. تراكب مع الأجسام المضادة الثانوية المترافقة بالإنزيم التي ترتبط بمجمعات الأجسام المضادة-p53. أضف ركيزة كيميائية لتوليد منتج مضيء وتصوير الغشاء.
يتوافق نطاق الوزن الجزيئي الأعلى مع البروتينات SUMOylated ، بينما يتوافق النطا
اعرض النص الكامل واحصل على الوصول إلى آلاف الفيديوهات العلمية