JoVE Encyclopedia of Experiments
التقنيات البيولوجية
0 مشاهدات • 2:59 د • July 8th, 2025
يتم تمييز البروتينات النووية غير المطوية التي تفتقر إلى بنية ثلاثية محددة بمعدلات صغيرة تشبه اليوبيكويتين ، و SUMOs ، وجزيئات يوبيكويتين ، مما يسهل تحللها بواسطة نظام الحالة للبروتين ، بما في ذلك نظام ubiquitin-proteasome ، UPS.
في العديد من الأمراض التنكسية العصبية ، يتسبب الخلل الوظيفي في UPS في تراكم وتجميع البروتينات النووية غير المطوية ، مما يؤدي إلى موت الخلايا العصبية.
للتحقيق في معدل تحلل البروتينات النووية غير المطوية في المختبر ، عالج مزرعة خلايا الثدييات الملتصقة بخليط يتكون من الحمض النووي البلازميد غير المطوي والمشفر للبروتين الفلوري وكاشف التعداد.
تعبر الخلايا التي تم نقلها بنجاح عن بروتينات غير مطوية قصيرة بعمر نصف الفلورسنت وتحمل علامة إشارة توطين نووية. عند نقلها إلى النواة ، تخضع هذه البروتينات غير المطوية للتوسع في كل مكان ويتم نقلها إلى UPS لتحلل البروتين وإزالته.
بعد الحضانة ، استبدل الوسط بوسط منخفض التألق يحتوي على cycloheximide. يرتبط Cycloheximide ، وهو جزيء قابل للاختراق للخلية ، بالوحدة الريبوزومية الكبيرة ويمنع مرحلة الاستطالة لترجمة البروتين وتخليق البروتين الإضافي ، مما يسهل دراسة معدل تحلل البروتينات غير المطوية المترجمة المسماة بالفلورسنت.
عالج مجموعة من الآبار بمثبط البروتيازوم لمنع نشاط البروتيازوم والتسبب في تراكم البروتينات غير المطوية. باستخدام قارئ صفيحة دقيقة ، قم بقياس تألق البروتينات غير المطوية.
يشير الانخفاض المعتمد على الوقت في التألق إلى تدهور البروتين غير المطوي. تظهر الخلايا المعالجة بمثبط البروتيازوم شدة مضان مماثلة بمرور الوقت ، مما يدل على تثبيط تحلل البروتين غير المطوي.
بعد البذر ونقل خلايا HeLa في 96 لوحة بئر وفقا لبروتوكول النص ؛ بعد 20 إلى 24 ساعة من التعداء ، افحص الخلايا بحثا عن تعبير GFP. قم بإزالة الوسيط عند حوالي 200 ميكرولتر من 1x PBS لكل بئر ، ثم قم بشفطه لإزالة DMEM المتبقي.
أضف 60 ميكرولتر من DMEM منخفض التألق مع 5٪ FBS ، و 50 ميكروغرام لكل ملليلتر من cycloheximide ، وأضف 10 ميكرومولار MG132 إلى مجموعة واحدة من العينات.
باستخدام قارئ اللوحة الفلورية ، قم بقياس إشارة GFP التي تقرأ اللوحات كل ساعة لمدة تصل إلى 8 إلى 10 ساعات. تصدير البيانات وإجراء التحليل الإحصائي وفقا لبروتوكول النص.