موسوعة JoVE للتجارب
التقنيات البيولوجية
0 مشاهدة • 3:11 دقيقة • July 8th, 2025
أثناء عدوى فيروس كورونا 2 ، أو SARS-CoV-2 ، يرتبط مجال ربط مستقبلات بروتين سبايك للفيروس ، RBD ، بالإنزيم المحول للأنجيوتنسين للخلية المضيفة 2 ، ACE2 ، مما يسهل دخول الخلايا الفيروسية. ردا على ذلك ، ينتج الجهاز المناعي أجساما مضادة ترتبط ب RBD الفيروسي وتمنع دخول الخلايا ، مما يقلل من العدوى الفيروسية.
للكشف عن الأجسام المضادة ل SARS-CoV-2 التي تستهدف RBD ، خذ معلق المراسل الحيوي المؤتلف الذي يتكون من شظايا بروتينية صغيرة الحجم ، مدمجة في SARS-CoV-2 spike RBD. أضف الأجسام المضادة القياسية ل SARS-CoV-2 التي تستهدف RBD والخرز المغناطيسي المرتبط بالأجسام المضادة.
أثناء الحضانة ، ترتبط منطقة الجسم المضاد Fc بمجالات ربط Fc للخرز. بالإضافة إلى ذلك ، يرتبط المراسل الحيوي المؤتلف بالأجسام المضادة ل SARS-CoV-2 المرتبطة بالخرز.
بعد الحضانة ، الطرد المركزي الخليط. قم بإزالة المادة الطافية غير المنضومة التي تحتوي على المراسل الحيوي. قم بإعادة تعليق الخرزات المقيدة في المخزن المؤقت. انقله إلى طبق متعدد الآبار.
أضف محلولا يحتوي على شظايا بروتينية كبيرة الحجم ، مع تقارب كبير مع شظايا البروتين صغيرة الحجم. ترتبط شظايا البروتين الكبيرة والصغيرة الحجم ببعضها البعض ، وتشكل إنزيم لوسيفيراز نشط هندسيا.
أضف فوريمازين ، ركيزة لوسيفيراز. يحفز لوسيفيراز أكسدة الفوريماازين ، مما يتسبب في انبعاث الضوء. باستخدام مقياس الإضاءة ، قم بقياس اللمعان ، مما يدل على وجود أجسام مضادة معادلة.
تشير شدة الإشارة العالية إلى تركيزات عالية من الأجسام المضادة ل SARS-CoV-2 التي تستهدف RBD.
من أجل إجراء مقايسة الكشف عن الأجسام المضادة HiBiT-RBD ، قم بإعداد المراسل الحيوي HiBiT-RBD ، واجمع بين 50 ميكرولترا من المادة الطافية المحتوية على HiBiT-RBD مع 1 ميكروغرام من الجسم المضاد التجاري SARS-CoV-2-RBD في أنبوب دقيق سعة 1.5 ملليلتر.
أضف 20 ميكرولترا من البروتين المرتبط بالغلوبولين المناعي ، أو البروتين G ، إلى المحلول. ارفع الحجم الإجمالي إلى 300 ميكرولتر عن طريق إضافة PBS. احتضان الأنابيب على شاكر أنبوب أو دوار لمدة 30 دقيقة ، وجهاز الطرد المركزي عند 12,000 × جم لمدة 30 ثانية ، ثم تخلص من المادة الطافية واغسلها باستخدام PBS. كرر العملية ثلاث مرات لإزالة HiBiT-RBD المجاني.
أعد تعليق الخلايا في 50 ميكرولترا من PBS ، وانقلها إلى لوحة 96 بئر. أضف 50 ميكرولترا من 1x LgBiT ، وانتظر لمدة 5 دقائق. ثم أضف 50 ميكرولترا من ركيزة 1x NanoLuc. اقرأ على الفور إشارة التلألؤ باستخدام مقياس الإضاءة.