اختبار الأجسام المضادة المعادلة للخلايا AAV: تقنية قياس الألوان للكشف عن الأجسام المضادة المعادلة ضد فيروسات معينة مرتبطة بالغدة في المصل

JoVE Encyclopedia of Experiments

التقنيات البيولوجية

0 مشاهدات • 4:54 د • July 8th, 2025

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الفيروسات المؤتلفة المرتبطة بالغدة ، rAAVs ، فيروسات الحمض النووي المعدلة وراثيا ، غير المغلفة ، أحادية الشريطة ، هي ناقلات جينية علاجية واعدة.

ترتبط rAAVs بمستقبلات غشاء الخلية المستهدفة وتخضع للالتقام الخلوي بوساطة الكلاثرين ، مما يسهل التوصيل النووي لجينوم rAAV والتعبير الجيني العلاجي. ومع ذلك ، فإن الأجسام المضادة المعادلة للجهاز المناعي الموجهة ضد rAAVs ترتبط بحتمة rAAV المحددة ، مما يتداخل مع ارتباط غشاء الخلية ، والدخول الخلوي ، ونقل الجينات.

للكشف عن الأجسام المضادة المعادلة ضد rAAVs معينة في مصل الأغنام ، أولا ، احصل على تركيزات مناسبة من المصل المخفف. أضف AAVs المؤتلف الذي يعبر عن الفوسفاتيز القلوي المشيمي البشري ، hPLAP ، الجين. السماح للأجسام المضادة المعادلة بربط وتحييد AAVs.

انقل هذا الخليط إلى آبار صفيحة متعددة الآبار تحتوي على ثقافة الخلايا الظهارية البشرية الملتصقة. عند الحضانة ، تخضع AAVs للالتقام الخلوي الخلوي. تعبر الخلايا المنقولة عن hPLAP المرتبط بغشاء الخلية. ومع ذلك ، لا يمكن أن تدخل AAVs المعادلة إلى الخلايا.

تخلص من الوسط من الآبار. استخدم بارافورمالدهيد لإصلاح الخلايا. أضف عازلة دافئة مسبقا ، وقم بتسخين الخلايا لتعطيل الفوسفاتيز القلوي الخلوي الذاتي ؛ hPLAP مقاوم للتعطيل الحراري.

أضف ركائز hPLAP - فوسفات بروموكلورويندوليل ، BCI ، والنيترو الأزرق tetrazolium ، NBT. hPLAP يزيل الفسفرة BCIP ، الذي يخضع للخثث ، مكونا وسيطا أزرق. تقلل أيونات الهيدروجين المنبعثة من NBT ، مما ينتج عنه راسب أرجواني غير قابل للذوبان. صورة لمراقبة الرواسب الأرجوانية المحيطة بالخلايا المنقولة.

تشير

نسبة أقل من المنطقة الأرجوانية إلى زيادة تركيز الأجسام المضادة المعادلة ل AAV.

ابدأ في طلاء خلايا HT1080 في اليوم الأول عن طريق تخفيف الخلايا إلى تركيز 1 × 105 خلايا / مل في وسائط DMEM كاملة تم تسخينها مسبقا.

بعد ذلك ، قم بزرع 100 ميكرولتر من الخلايا ، لكل بئر ، في ألواح شفافة ذات قاع مسطح 96 بئرا بتركيز 1 × 104 خلايا لكل بئر. احتضان اللوحة عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون طوال الليل لمدة 16 إلى 22 ساعة.

في اليوم الثاني ، قم بإنشاء تخفيفات تسلسلية لعينات المصل ذات الأهمية في أنابيب الطرد المركزي الدقيقة سعة 1.5 مليلتر باستخدام DMEM كامل التسخين مسبقا.

إلى كل أنبوب به عينات مصل مخففة ، أضف 66 ميكرولتر من الجينوم الفيروسي 7.5 × 106 لكل محلول عمل للفيروس ميكرولتر. امزج المخففات الفيروسية / المصل عن طريق الماصة ، ثم ضع الأنابيب التي تحتوي على مخاليط الفيروس / المصل في حاضنة عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة 30 دقيقة ، للسماح بحدوث تحييد محتمل.

بعد 30 دقيقة ، قم بتمرير 100 ميكرولتر من خليط الفيروس / المصل إلى كل بئر على الصفيحة المكونة من 96 بئرا تحتوي على 1 × 104 خلايا لكل بئر ، ثم لف اللوحة بورق لوضعها في حاضنة عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون طوال الليل لمدة 16 إلى 24 ساعة.

في اليوم الثالث ، قم بشفط الوسائط من آبار الصفيحة المكونة من 96 بئرا باستخدام فراغ غطاء الدخان دون تعطيل الخلايا الملتصقة ، وأضف 50 ميكرولترا من 4٪ بارافورمالدهيد إلى كل بئر. بعد لف الطبق بورق القصدير ، اتركه لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة.

في وقت لاحق ، اغسل الخلايا وشفطها مرتين باستخدام 200 ميكرولتر من PBS في درجة حرارة الغرفة. بعد الغسيل الثاني ، قم بإدخال 200 ميكرولتر من PBS الدافئ مسبقا في كل بئر ، ولف اللوحة بورق الألمنيوم متبوعا بالحضانة عند 65 درجة مئوية لمدة 90 دقيقة لتغيير طبيعة نشاط الفوسفاتيز القلوي الذاتي.

بعد الحضانة ، أضف 50 ميكرولترا من BCIP / NBT المحضرة حديثا والمذابة في كل بئر ، واحتضن الأطباق الملفوفة في درجة حرارة الغرفة لمدة 2 إلى 24 ساعة. في وقت لاحق ، التقط صورا لكل بئر باستخدام عدسة موضوعية 4x في كاميرا مجهر ضوئي ، مما يضمن الاستخدام المتسق لنفس التعريض الضوئي ، والتوازن الأبيض ، وإعدادات الإضاءة لجميع الفحوصات.

12:09

قياس الإنفلونزا تحييد ردود الأجسام المضادة للفيروسات A(H3N2) في الأمصال البشرية قبل درياقي فحوصات باستخدام خلايا مدكك-SIAT1

فيديوهات ذات صلة

0 مرات المشاهدة

07:52

الكشف عن الأجسام المضادة التي تحييد استيعاب الخلوية لأنزيم استبدال العلاجات مع تحليل يستند إلى الخلية

فيديوهات ذات صلة

0 مرات المشاهدة

08:13

محسن انترفيرون-غاما السبت المقايسة لاستجابات الخلية تي التدبير في نموذج خنزير غينيا بعد التطعيم

فيديوهات ذات صلة

0 مرات المشاهدة

06:57

فحص Dot Blot لتحديد الجينوم الفيروسي

فيديوهات ذات صلة

0 مرات المشاهدة

05:33

اختبار تحييد دقيق لقياس عيار الأجسام المضادة المعادلة في المصل البشري

فيديوهات ذات صلة

0 مرات المشاهدة

03:17

تحليل العلاقة المستضدية بين الفيروسات باستخدام مقايسة التحييد الدقيق المستندة إلى الصور

فيديوهات ذات صلة

0 مرات المشاهدة

04:05

طريقة التألق المناعي لقياس تحييد الفيروس المضخم للخلايا البشري

فيديوهات ذات صلة

0 مرات المشاهدة

12:02

فحوصات لتحديد رواية الأدوية المضادة للفيروسات ضد فيروس اللسان الأزرق

فيديوهات ذات صلة

0 مرات المشاهدة

10:09

الاستفادة المثلى من الكمية الصغيرة تحييد الفحص

فيديوهات ذات صلة

0 مرات المشاهدة

14:49

مقايسة دوت كمية وصمة عار لمعايرة إف واستخدامها لتقييم وظيفي للفيروسات المرتبطة بالغدة الجمعية-تفعيل البروتينات

فيديوهات ذات صلة

0 مرات المشاهدة

آخر تحديث: 15 أغسطس 2026