JoVE Encyclopedia of Experiments
التقنيات البيولوجية
0 مشاهدات • 3:03 د • July 8th, 2025
توازن البروتين الخلوي ، أو البروتين ، تنظيم طي البروتين ووظيفته ، إلى جانب تدهور البروتينات غير المطوية. أثناء الشيخوخة ، تنخفض آلية البروتينات ، مما يتسبب في تراكم البروتينات غير المطوية والمزيد من التراكم ، مما يؤدي إلى خلل في الخلايا.
لتحديد انخفاض البروتينات المرتبطة بالعمر ، ابدأ بالتهاب كينورhabditis البالغ المعدل وراثيا المتزامن نمويا.
تعبر الخلايا العضلية لهذه الديدان عن البروتينات مع تكرار بولي جلوتامين المتوسع بشكل غير طبيعي ، أو polyQ ، المدمجة بعلامة الفلورسنت. بروتينات PolyQ عرضة للطي الخاطئ ، وبالتالي عند التراكم ، يمكن أن تشكل مجاميع.
انقل الديدان إلى شريحة مجهرية تشتمل على وسادة الاغاروز وقم بتثبيتها بمادة كيميائية مناسبة لتصوير الخلايا الحية. باستخدام المجهر الفلوري ، تصور عضلات جدار جسم الديدان على مدى فترة زمنية لتحديد إشارات البؤر الفلورية الساطعة ، المقابلة لمجاميع polyQ الفلورية.
في غضون أيام ، بسبب انخفاض البروتين المرتبط بالعمر ، يحدث تراكم تراكمي تدريجي للبروتين ، مما يؤدي إلى زيادة عدد بؤر الفلورسنت. تسبب مجاميع polyQ المتزايدة في خلايا العضلات سمية وتعطل وظيفة الخلايا العضلية ، مما يؤدي إلى الشلل.
تحت المجهر ، سجل عدد الديدان الحية المشلولة التي تفتقر إلى الحركة على المحفزات الميكانيكية. يشير معدل شلل الديدان المتزايد إلى انخفاض البروتين المرتبط بالعمر في الأنسجة العضلية في الديدان.
لقياس انخفاض البروتين في الأنسجة العضلية ، اختر 20 ، وقم بتثبيتها على شريحة مجهرية مع وسادة أغروز 3٪ وقطرة 5 ميكرولتر من أزيد الصوديوم 10 ملليمول.
بعد تجميد جميع الديدان ، قم بتصوير أجسام بالكامل باستخدام عدسة تكبير 10x. استخدم مرشح FITC أو YFP ، ونفس التعرض ، لكل. عند الانتهاء، تجاهل الشرائح.
احسب عدد البؤر في عضلات جدار الجسم للحيوان بأكمله. البؤر هي إشارات أكثر إشراقا ومتخللة يمكن تمييزها عن الإشارة القابلة للذوبان في الخلفية.
في أيام التسجيل ، انظر إلى الصفائح مع ، وسجل عدد المشلولة. ثم قم بإزالة المشلولة من اللوحة.
عند الانتهاء من التجربة ، احسب معدل الشلل لكل حالة ، وارسم تطور الشلل.