مقايسة متجانسة للقرب المضيء المضخم: اختبار القرب القائم على الخرزة لفحص الجزيئات الصغيرة التي تمنع تفاعلات البروتين والبروتين

في الأنظمة البيولوجية ، يعد قرب البروتين من شريكه المحدد محددا حاسما للتفاعل الناجح بين البروتين والبروتين. مع وجود جزيئات مثبطة صغيرة ، لا يمكن لهذه البروتينات التحرك بالقرب من بعضها البعض ، مما يعطل تفاعلاتها.

لفحص الجزيئات المثبطة لتعطيل التفاعلات بين بروتينين - مرافق ومرافق مشارك - خذ صفيحة متعددة الآبار تحتوي على جزيئات صغيرة مختلفة. استكمل الآبار بخرز المتبرع الذي يحتوي على مرافقين مشتركين متصلة بأسطحها. تحتوي هذه الخرزات على محسسات ضوئية لمقايسة التلألؤ الكيميائي.

أضف ملاط من حبات المستقبل المقترنة بتسلسلات الببتيد المشتقة من المرافق والتي ترتبط على وجه التحديد بالمرافق المشترك. تحتوي الخرزات على صبغة أساسها الثيوكسين وفلوروفورات ضرورية للتصور.

في الآبار ذات الجزيئات غير المثبطة ، تجذب الصلات العالية بين الببتيدات المرتبطة بالمرافق والخرز المتبرع والمتبرع. بينما تظل الخرزات بعيدة عند وجود مثبطات.

باستخدام قارئ التلألؤ الكيميائي ، ادرس التفاعل. عند الإضاءة بطول موجي معين ، تنبعث المحسسات الضوئية للحبة المانحة من الأكسجين المفردة عالية التفاعل.

مع عدم وجود جزيئات مثبطة ، تصل الأنواع المنبعثة إلى حبات مستقبلية قريبة من حبات الصبغة وتتفاعل مع جزيئات الصبغة ، مما يتسبب في تلألؤ الكيمياء. تنشط هذه الطاقة الفلوروفورات الخاصة بخرز المستقبل ، مما يتسبب في انبعاث الضوء.

في المقابل ، في الآبار ذات الجزيئات المثبطة ، تخضع الأكسجين المفردة للاضمئنان ، مما يؤدي إلى عدم انبعاث الضوء ، مما يشير إلى تثبيط ناجح لتفاعلات البروتين والبروتين.

أضف حبات مانحة للجلوتاثيون بتركيز 10 ميكروغرام لكل مليلتر في PBS. أضف GST-FKBP51 إلى التركيز النهائي البالغ 10 ميكروغرام لكل مليلتر ، واحتضن التفاعل لمدة 10 دقائق عند 25 درجة مئوية في الظلام.

قم بعمل تخفيفات تسلسلية لمركب الاختبار في DMSO. أضف 0.25 ميكرولتر من التخفيفات المركبة للاختبار في ثلاث نسخ ، في زاوية كل بئر من صفيحة 384 بئر.

للتحكم السلبي ، أضف 0.25 ميكرولتر من DMSO ، وللتحكم الإيجابي ، أضف 0.25 ميكرولتر من الببتيد الطرفي Hsp90 C في الآبار.

أضف 22.5 ميكرولترا من المحلول الذي يحتوي على حبات مانحة بالجلوتاثيون مع بروتينات تحمل علامة ضريبة السلع والخدمات إلى كل بئر. رج الطبق جيدا باليدين واحتضنه في الظلام عند 25 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة.

قم بتخفيف حبات المستقبل باستخدام الببتيد الطرفي Hsp90 C المرفق إلى 100 ميكروغرام لكل تركيز مليلتر في 0.5x PBS. أضف 2.25 ميكرولتر من حبات المستقبل المخففة إلى كل بئر. رج الطبق واحتضانه في الظلام لمدة 15 دقيقة كما هو موضح

.

قم بتشغيل أداة قارئ اللوحة ، وقم بقياس إشارة اللوحة ، وحلل البيانات كما هو موضح في المخطوطة النصية.