JoVE Encyclopedia of Experiments
التقنيات البيولوجية
0 مشاهدات • 3:43 د • July 8th, 2025
للبدء ، قم بإعداد التخفيفات المتسلسلة لفيروس الهربس البسيط ، وهو فيروس معد مغلف ، في المخزن المؤقت.
احصل على صفيحة متعددة الآبار تحتوي على طبقة أحادية من زراعة الخلايا الظهارية المعرضة للفيروسات. استبدل حجما معدلا من الوسائط بمعلقات فيروسية مخففة، مما يضمن تغطية أحادية الطبقة. اسمح للفيروس بالامتصاص على سطح الخلية.
قم بإزالة أي فيروسات غير ممتصة. قم بتغطية طبقة الخلية أحادية الطبقة بوسائط تحتوي على ميثيل السليلوز ، لتشكيل تراكب شبه صلب.
عند الحضانة ، يندمج الغلاف الفيروسي وغشاء الخلية ، مما يؤدي إلى إطلاق النوكليوكابسيد الفيروسي الذي يحيط بالجينوم مزدوج الشريطة في السيتوبلازم. علاوة على ذلك ، يتم إطلاق الجينوم الفيروسي في نواة الخلية.
باستخدام الآلية الخلوية للمضيف وبروتين الفيروس ، يعبر الجينوم الفيروسي عن البروتينات الفيروسية المبكرة الفورية ، والتي تنظم التعبير عن الجينات المبكرة. تتوسط البروتينات الفيروسية المبكرة في تكرار الحمض النووي الفيروسي.
بعد ذلك ، تعبر الجينات الفيروسية المتأخرة عن البروتينات الهيكلية ، والتي تتجمع جنبا إلى جنب مع الجينوم الفيروسي لإنتاج جزيئات فيريون ذرية. الخلايا المصابة بالفيروس تتحلل وتطلق الفيروسات.
يقيد ميثيل السليلوز حركة الفيروس ، مما يتسبب في إصابة الفيروسات بالخلايا المجاورة فقط والتحلل اللاحق ، مما يخلق ثقوبا في الطبقة الأحادية.
بعد الحضانة ، قم بإزالة تراكب ميثيل السليلوز. أضف محلول البنفسجي البلوري الإيثانولي. يعمل الإيثانول على إصلاح الخلايا وتعطيل الفيروسات ، بينما يلطخ البنفسج الكريستالي الخلايا. نتيجة لذلك ، تظهر مناطق أو لويحات واضحة على طبقة أحادية الخلية الأرجوانية.
عد اللويحات في كل بئر عند كل تخفيف للفيروس لتحديد عيار الفيروس المعدي أو تركيزه.
قم بإزالة وسط زراعة الخلايا من بئر أو بئرين باستخدام ماصة. بعناية ، أضف عينة الفيروس المخففة إلى كل طبقة أحادية من الخلايا ، بالتنقيط من خلال جانب كل بئر.
كرر العملية لكل بئر أو بئرين حتى تمتلئ اللوحة بأكملها بعينات الفيروس التي يتم تلويتها. هز الطبق بأكمله يدويا برفق.
ثم احتضن اللوحة عند 37 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة للسماح بامتصاص الفيروس. بعد كل 10 دقائق ، قم بإزالة اللوحة من الحاضنة ، وهزها برفق مرة أخرى لنشر الفيروس بشكل متساو عبر كل بئر ، ثم ضعها مرة أخرى في الحاضنة.
لتقليل إمكانية عد اللقاح غير الممتص عن غير قصد ، قم بإزالة عينة الفيروس من الآبار باستخدام طرف ماصة سعة 1,000 ميكرولتر ، وتخلص من العينة في دورق النفايات.
ضع 2.5 مل من تراكب ميثيل السليلوز على الطبق ، وضعه مرة أخرى في الحاضنة. قم بتطهير دورق النفايات ، عادة بإضافة المبيض أو اليودوفور أو مبيد فيروسات مماثل ، قبل إزالته من خزانة السلامة الحيوية.
بعد الحضانة لمدة يومين ، قم بإزالة تراكب ميثيل السليلوز من بئر أو بئرين في كل مرة ، باستخدام ماصة ، وضعها في دورق نفايات. أضف ما يقرب من 2 مل من البنفسج البلوري 1٪ و 50٪ إيثانول لكل بئر. احتضان اللوحة بجميع الآبار المملوءة بالبقعة لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية.
في هذه المرحلة ، قم بتطهير دورق النفايات ، كما هو موضح سابقا. اغسل الأطباق بقوة بماء الصنبور حتى يصبح الجريان السطحي صافيا.
تأكد من وجود اختلافات بمقدار 10 أضعاف تقريبا في عدد اللويحات عبر كل سلسلة تخفيف.