JoVE Encyclopedia of Experiments
التقنيات البيولوجية
0 مشاهدات • 5:32 د • July 8th, 2025
تخضع الخلايا المضيفة المصابة بمسببات الأمراض الميكروبية لموت الخلايا المبرمج - موت الخلايا المبرمج. أثناء موت الخلايا المبرمج ، تؤدي الحمض النووي إلى تحلل الحمض النووي للكروموسومات إلى أجزاء صغيرة ، مما يؤدي إلى موت الخلايا.
للكشف عن موت الخلايا المبرمج باستخدام مقايسة TUNEL ، خذ شريحة زجاجية بها قسم من أنسجة الجلد منزوع البارافينات والمعاد ترطيبه مصاب بممرض فطري.
عالج الأنسجة بالبروتيناز K لتعطيل DNases الخلوية ، ومنعها من تدهور الحمض النووي أثناء التحليل. أضف بيروكسيد الهيدروجين لإخماد التفاعل ، واغسل الشريحة لإزالة البروتيناز K غير المتفاعل.
أضف المخزن المؤقت الذي يحتوي على ثلاثي فوسفات ديوكسيجينين يوريدين المسمى بالديجوكسيجينين ، أو dUTPs. استكمله بترانسفيراز ديوكسي نيوكليوتيديل الطرفي ، وإنزيم TdT ، واحتضانه. في الخلايا موت الخلايا المبرمج ، يحفز إنزيم TdT ارتباط dUTPs المسمى بمجموعات 3′-hydroxyl المكشوفة للحمض النووي المجزأ.
بعد ذلك ، أضف جسما مضادا مضادا للديجوكسيجينين مقترنا إلى مراسل الرودامين ، واحتضنه في الظلام لتسهيل ارتباط الجسم المضاد ب dUTPs المسمى digoxigenin ، مما يضفي مضان أحمر عند التصوير.
عالج عينات الأنسجة باستخدام صبغة نواوية فلورية لتصور النوى. ضع غطاء فوق قسم الأنسجة ، وتصوره تحت المجهر الفلوري.
يساعد التألق الأزرق في تحديد نوى جميع الخلايا في قسم الأنسجة ، بينما يشير وجود التألق الأحمر في الخلايا الملطخة بالرودامين إلى تجزئة الحمض النووي بسبب موت الخلايا المبرمج.
لبدء هذا الإجراء ، قم بإعداد شرائح زجاجية محبة للماء مع عينة من الأنسجة ، كما هو موضح في بروتوكول النص.
لإزالة البارافينات من أقسام الأنسجة ، اغسل الشرائح ثلاث مرات بالزيلين ، لمدة 5 دقائق لكل منها ، في وعاء كوبلين. بعد ذلك ، اغسل الشرائح بالإيثانول بنسبة 100٪ مرتين لمدة 5 دقائق لكل منهما. بعد ذلك ، اغسل الشرائح بنسبة 95٪ إيثانول و 70٪ إيثانول لمدة 3 دقائق لكل منهما ، ثم اغسل الشرائح مرة واحدة باستخدام PBS لمدة 5 دقائق.
لتحضير شرائح التحكم التجريبية والسلبية، قم بمعالجة الأنسجة مسبقا عن طريق إضافة البروتيناز K المخفف حديثا مباشرة إلى الشرائح. احتضن الشرائح لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة ، ثم اغسل الشرائح في PBS مرتين لمدة دقيقتين لكل منهما.
لتحضير شرائح التحكم الإيجابية ، قم بمعالجة الأنسجة مسبقا باستخدام مخزن DN المؤقت ، ثم احتضان الشرائح في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق. بعد ذلك ، مذاب DNase I في المخزن المؤقت DN إلى تركيز نهائي قدره 0.1 ميكروغرام لكل مليلتر. أضف محلول الحمض النووي المحضر إلى الشرائح. احتضن الشرائح لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة ، ثم اغسل الجوانب بالماء المقطر في وعاء كوبلن خمس مرات ، لمدة 3 دقائق لكل منها.
قم بإخماد التفاعل في بيروكسيد الهيدروجين بنسبة 3٪ في PBS لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة. بعد ذلك ، اغسل الشرائح في PBS مرتين لمدة دقيقتين لكل منهما. ثم أضف عازلة التوازن إلى الأنسجة الموجودة على الشرائح. احتضن لمدة 10 ثوان في درجة حرارة الغرفة ، ثم اضغط على السائل الزائد حول قسم الأنسجة.
قم بتخفيف إنزيم ديوكسي نوكليوتيديل ترانسفيراز الطرفي في المخزن المؤقت للتفاعل ، ثم أضفه إلى الأنسجة الموجودة على شرائح التحكم التجريبية والإيجابية. احتضان في غرفة رطبة لمدة 1 ساعة عند 37 درجة مئوية.
بعد ذلك ، ضع الشرائح في جرة كوبلين تحتوي على تركيز العمل للمخزن المؤقت للتوقف. حرك لمدة 15 ثانية ، ثم احتضن الشرائح في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق. بعد ذلك ، اغسل الشرائح باستخدام PBS ثلاث مرات لمدة 1 دقيقة لكل منها ، واضغط على السائل الزائد.
بعد ذلك ، أضف المقترن المضاد للديجوكسيجينين المسخن مسبقا إلى درجة حرارة الغرفة مباشرة على الأنسجة. احتضان الشرائح لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة في غرفة مظلمة رطبة.
بعد اكتمال الحضانة ، اغسل الشرائح باستخدام PBS أربع مرات لمدة دقيقتين لكل منهما. اضغط على أي سائل زائد. ثم أضف وسيط التثبيت إلى الجانبين. أضف 15 ميكرولترا من محلول DAPI إلى وسط التركيب على الشرائح. قم بتغطية كل شريحة بغطاء ، وأغلقها بطلاء الأظافر. اترك الشرائح تجف في الظلام.
باستخدام مجهر الفلورسنت ، راقب الشرائح فور الانتهاء من عملية التلوين.
التقط صورا بمقدار 400 مرة على فترات عشوائية على طول كل قسم من أقسام الجلد. عد الخلايا الزرقاء الملطخة ب DAPI للتأكد من ظهور ما لا يقل عن 100 خلية لكل قسم من الجلد ، لكل. بعد ذلك ، احسب عدد الخلايا الموجبة ل TUNEL التي تظهر كخلايا مفردة حمراء ذات حواف خلية واضحة.