موسوعة JoVE للتجارب
التقنيات البيولوجية
0 مشاهدة • 2:54 دقيقة • July 8th, 2025
Caspase-3 و caspase-7 عبارة عن بروتياز يتعرف على تسلسل DEVD رباعي الببتيد في البروتينات المستهدفة ، مما يؤدي إلى شقهما عند الطرف C من بقايا حمض الأسبارتيك. تلعب هذه دورا بارزا في موت الخلايا المبرمج - موت الخلايا المبرمج - تتالي.
لتقييم نشاط caspase-3/7 في الخلايا موت الخلايا المبرمج ، ابدأ بأنبوب يحتوي على نبتة جلد إصبع الضفدع المصاب بالفطريات المسببة لموت الخلايا المبرمج. أضف عازلة مناسبة إلى الأنبوب وبعض الخرز المعدني.
استخدم الخرز لتعطيل خلايا الجلد وإطلاق المحتويات الخلوية ، بما في ذلك بروتينات كاسباز 3/7. الطرد المركزي للأنبوب ، وتكوير حطام الخلايا ، والعضيات. استنشق المادة الطافية الغنية بالبروتين من الأنبوب والماصة إلى آبار لوحة فحص متعددة الآبار.
استكمل الآبار بكاشف الكاسباز المضيء. يتكون هذا الكاشف من ركيزة متألوفة تحتوي على ببتيد DEVD في محلول مخزن يحتوي على ATP وأيونات المغنيسيوم وإنزيم لوسيفيراز.
اخلطي محتويات البئر وحتضنها. أثناء الحضانة ، يشق caspase-3/7 الركيزة المتلألئة ، ويطلق أمينولوسيفيرين - ركيزة لوسيفيراز - في المحلول.
في وجود أيونات ATP والمغنيسيوم ، يؤكسد لوسيفيراز الأمينولوسيفيرين المنبعث ، مما ينتج عنه منتج مضيء بيولوجيا. تتناسب كمية الضوء الناتجة أثناء التفاعل مع نشاط الكاسباز.
لاستخراج البروتينات من عينة إصبع الضفدع المجمدة، ضع العينة في أنبوب طرد مركزي
اعرض النص الكامل واحصل على الوصول إلى آلاف الفيديوهات العلمية