مقايسة البلعمة: تقنية تلغيم مناعي لتصور ابتلاع الخلايا المبرمج في الخلايا الجنينية ذبابة الفاكهة السوداء

البلاعم هي خلايا مناعية متخصصة تزيل الخلايا التي تخضع لموت الخلايا المبرمج - موت الخلايا المبرمج عن طريق البلعمة.

لتقييم ابتلاع الخلايا المبرمجة ، ابدأ بشريحة زجاجية تحتوي على ذبابة الفاكهة الخلايا الجنينية الثابتة ، بما في ذلك الأجسام موت الخلايا المبرمج التي تبتلعها الخلايا الدموية - البلاعم اللافقارية.

أولا ، عالج الخلايا بكاشف مانع يحجب المواقع غير المحددة. أضف الأجسام المضادة الأولية التي تربط مستقبلات الكروكيمورت - علامات البلعمة للخلايا الدموية. اغسل الأجسام المضادة الزائدة.

أضف الأجسام المضادة الثانوية المسماة بالفوسفاتيز القلوية والتي ترتبط بالأجسام المضادة الأولية. الآن ، أضف محلول ركيزة كروموجينيك مناسب على الشريحة ، واحتضنها. أثناء الحضانة ، يتفاعل الفوسفاتيز القلوي مع الركيزة الكروموجينيكية لإنتاج حبيبات ملطخة باللون الأرجواني في الخلايا الدموية.

بعد ذلك ، أضف خليط تفاعل يتكون من ديوكسينوكليوتيديل ترانسفيراز طرفي ، وإنزيم TdT ، والنيوكليوتيدات المرتبطة بالديجوكسيجينين. يحفز TdT ارتباط النيوكليوتيدات المرتبطة بالديجوكسيجينين بنهايات 3 'OH المكشوفة للحمض النووي المجزأ في الأجسام موت الخلايا المبرمج.

بعد ذلك ، أضف الأجسام المضادة للديجوكسيجينين المقترنة بمراسل البيروكسيداز التي ترتبط بالنيوكليوتيدات في موقع تلف الحمض النووي. عالج الخلايا بمحلول ركيزة كروموجينيك خاص بالبيروكسيداز ، واحتضانه. يحفز بيروكسيداز أكسدة الركيزة ، ويولد رواسب ملونة ويلطخ الأجسام موت الخلايا المبرمج باللون البني.

أخيرا ، تصور الخلايا تحت المجهر الضوئي. يشير الوجود المشترك للحبيبات الأرجوانية والإشارات البنية من الخلايا إلى الخلايا الدموية التي تحتوي على أجسام موت الخلايا

المبرمج.

لتلطيخ الخلايا بجسم مضاد مضاد للكرومورت ، أولا ، نقع الشريحة بشكل متسلسل في الميثانول ، ثم PBS مكمل بنسبة 0.2٪ Triton X-100 ، متبوعا ب PBS وحده. بعد ذلك ، قم بحظر الارتباط غير المحدد ب 20 ميكرولتر من مصل الخنازير الكامل بنسبة 5٪ في PBS + 0.2٪ Triton X-100 ، لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. قم بإزالة محلول الحجب الزائد ، وقم بتسمية الخلايا ب 20 ميكرولترا من مصل مضاد للكرومورت عند 4 درجات مئوية طوال الليل.

في صباح اليوم التالي ، اغسل الشريحة في PBS + Triton X-100 لمدة خمس حضانات لمدة 10 دقائق. بعد الغسيل الأخير ، اشطف الشريحة في PBS لمدة 10 دقائق. بعد ذلك ، قم بتسمية الخلايا ب 20 ميكرولترا من IgG المضاد للفئران المسمى بالفوسفاتيز القلوي في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة واحدة.

في نهاية الحضانة ، اغسل الشريحة خمس مرات في PBS + Triton X-100 كما هو موضح ، متبوعا بنقع لمدة 10 دقائق في محلول عازل. بعد ذلك ، قم بتسمية الخلايا بمحلول ركيزة الفوسفاتيز ، وراقب الخلايا تحت المجهر الضوئي.

عندما تظهر إشارات أرجوانية قوية في حبيبات الخلايا الدموية ، قم بإزالة الركيزة الزائدة ، وانقع الشريحة في مخزن مؤقت مكمل ب EDTA لمدة 5 إلى 10 دقائق. في نهاية الحضانة ، اشطف الخلايا بغسلتين من PBS لمدة 5 دقائق ، وعالجها بمخزن مؤقت للتوازن لمدة 10 دقائق.

بعد إزالة المحلول ، قم بتسمية الخلايا ب 20 ميكرولترا من محلول ديوكسي نوكليوتيديل ترانسفيراز الطرفي عند 37 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة. ثم قم بإزالة المحلول من الشريحة ، وانقع الخلايا في 0.5 مل توقف المخزن المؤقت للغسيل في 17 مل من الماء ، لمدة 10 دقائق. بعد ذلك ، اشطف الخلايا بثلاث غسلات PBS لمدة 5 دقائق ، وقم بتسميتها ب 20 ميكرولترا من بيروكسيداز مضاد للديجوكسيجينين لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.

في نهاية الحضانة ، اغسل الخلايا أربع مرات في PBS ، كما هو موضح ، وانقع الشريحة في ركيزة البيروكسيديز بزيادات قدرها 30 ثانية حتى تتحول الخلايا المبرمج إلى اللون البني. عندما يتم تحقيق التلوين الأمثل ، انقع الشريحة في الماء لإيقاف تفاعل البيروكسيداز.