اختبار مراسل البويضة المفردة في المختبر: تقنية لدراسة تنظيم ترجمة الرنا المرسال المستهدف أثناء نضوج البويضات في المختبر

البويضات في الطور الأول من الانقسام الاختزالي نشطة من الناحية النسخية؛ فهي تنتج الرنا المرسال وتخزنها في شكل نائم. أثناء النضج ، عندما تدخل البويضة في الطور ، تترجم mRNAs المخزنة إلى بروتينات.

لدراسة ترجمة mRNA ، ابدأ ببويضات الفأر المعتقلة من الطور الأول المعلقة في قطرة من الوسط. ضع الماصة المثبتة بالقرب من بويضة واحدة لتثبيتها في موضعها.

خذ ماصة حقن دقيقة تحتوي على مزيج مراسل. يحتوي هذا المزيج على نوعين متميزين من mRNA ، أحدهما يشفر بروتين الفلورسنت الأصفر ، أو YFP - مراسل مدمج مع المنطقة 3'-غير المترجمة من الجين المستهدف - و mRNA متعدد الأدينيل يشفر بروتين الفلورسنت الأحمر.

حقن مزيج المراسل في البويضة. احتضان البويضات المحقونة الدقيقة في وسط نضج مكمل بسيلوستاميد - مثبط كيميائي يحافظ على توقف الطور الأول.

تترجم البويضة mRNA متعدد الأدينيل حتى تصل شدة التألق الأحمر إلى هضبة ، بينما تظل مستويات mRNA المشفر YFP التي تفتقر إلى ذيل بولي الأدينيل على هذا النحو.

انقل البويضات المعالجة إلى وسط نضج بدون سيلوستاميد ، مما يساعد على استئناف الانقسام الاختزالي ؛ ويخضع الرنا المرسال المستهدف للترجمة لإنتاج البروتين المستهدف المدمجة مع مراسل الفلورسنت الأصفر.

قم بإجراء تصوير بفاصل زمني لتصور إشارات التألق على فترات منتظمة.

تظهر البويضات المحقونة مستويات ثابتة من التألق الأحمر ، بينما يزداد التألق الأصفر بمرور الوقت ، مما يشير إلى الترجمة والتراكم التدريجي لبروتينات المراسل.

للبدء ، افتح البصيلات التاجية بعناية عن طريق عمل قطع صغير في جدار المسام بإبرة قياس 26. اعزل COCs السليمة بعدة طبقات من الخلايا الركامية باستخدام ماصة زجاجية تعمل بالفم. استخدم ماصة أصغر وقم بنزع الكربون ميكانيكيا عن طريق سحب العينة المتكرر.

استنشق البويضات المجردة من الخليط ، وضعها في طبق بتري مع وسط النضج المكمل ب 1 ميكرومولار من سيلوستاميد. ضع الطبق في حاضنة لمدة ساعتين ، للسماح للبويضات بالتعافي من الإجهاد الناجم عن عزلتها عن البصيلات.

ضع أنبوبا شعريا من زجاج البورسليكات بطول 10 سم ، ومجتذبا ميكانيكيا لتحضير إبر الحقن. ثني طرف الإبرة بزاوية 45 درجة باستخدام خيوط ساخنة للحقن الأمثل. ضع قطرات سعة 20 ميكرولتر من وسط جمع البويضات الأساسية في طبق من البوليسترين ، وقم بتغطية القطرات بالزيت المعدني الخفيف.

قم بإعداد حجم أكبر من مزيج المراسلين عن طريق إضافة 12.5 ميكروغرام لكل ميكرولتر من Ypet UTR و mCherry لكل منهما. قم بتخزين كميات من هذه عند 80 درجة مئوية تحت الصفر. عند الذوبان ، قم بالطرد المركزي للكمية لمدة دقيقتين عند 20,000 × جم. ثم قم بنقله إلى أنبوب طرد مركزي دقيق جديد.

قم بتحميل إبرة الحقن بحوالي 0.5 ميكرولتر من مزيج المراسل. ضع الماصة المثبتة وإبرة الحقن في الحوامل ، وضعها في قطرة وسط جمع البويضات.

افتح إبرة الحقن عن طريق النقر عليها برفق على الماصة المثبتة. ضع البويضات في قطرة من وسط التجميع الأساسي ، وحقن 5 إلى 10 بيكوليتر من مزيج المراسل. احتضان البويضات في وسط النضج باستخدام 1 ميكرومولار سيلوستاميد لمدة 16 ساعة للسماح لإشارة mCherry بالاستقرار.

للفحص المجهري بفاصل زمني ، قم بإعداد طبق بتري مع قطرتين سعة 20 ميكرولتر من وسط النضج لكل مراسل محقون. قطرة واحدة مع 1 ميكرومولار سيلوستاميد للتحكم في البويضات المعتقلة بالطور الأولي ، وقطرة واحدة بدون سيلوستاميد لنضج البويضات. غطي القطرات بالزيت المعدني الخفيف وضعيها في الحاضنة.

بعد الحضانة المسبقة ، قم بإزالة البويضات المحقونة من الحاضنة ، واغسلها أربع مرات في وسط النضج بدون سيلوستاميد. احتفظ ببعض البويضات في وسط النضج مع 1 ميكرومولار سيلوستاميد كمجموعة تحكم في البويضات الأولية الأولية.

انقل البويضات المحقونة إلى قطراتها الخاصة على طبق المجهر بفاصل زمني معد مسبقا. قم بتجميع البويضات بماصة زجاجية مغلقة لمنع حركتها أثناء التسجيل.

ضع الطبق تحت المجهر المزود بنظام إضاءة الصمام الثنائي الباعث للضوء ، ومرحلة آلية مجهزة بغرفة بيئية يتم الحفاظ عليها عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون ، باستخدام المعلمات المذكورة في المخطوطة النصية.

أدخل الإعدادات المناسبة لتجربة الفاصل الزمني بالنقر فوق "التطبيقات" ثم "اكتساب متعدد الأبعاد". حدد علامة التبويب الأولى "رئيسي" وحدد "الفاصل الزمني" و "مواضع متعددة المراحل" و "الأطوال الموجية المتعددة".

حدد علامة التبويب "حفظ" لإدخال الموقع الذي يجب حفظ التجربة فيه. ثم حدد علامة التبويب "الفاصل الزمني" لإدخال عدد النقاط الزمنية والمدة والفاصل الزمني. حدد علامة التبويب "المرحلة". قم بتشغيل brightfield وحدد موقع البويضات عن طريق فتح نافذة جديدة وتحديد "اكتساب" و "اكتساب" و "عرض مباشر".

بمجرد تحديد موقع البويضات ، ارجع إلى "نافذة الاستحواذ متعددة الأبعاد" ، واضغط على "+" لتعيين موقع البويضات. حدد علامة التبويب "الأطوال الموجية" ، وقم بتعيين ثلاثة أطوال موجية مختلفة ل brightfield و YFP و mCherry. اضبط درجة الإضاءة ل Ypet و mCherry. بعد ذلك ، ابدأ تجربة الفاصل الزمني بالنقر فوق "اكتساب".

لتحليل ترجمة Ypet-3 'UTR ، قم بإجراء قياسين للمنطقة لكل بويضة. البويضة نفسها عن طريق قص "منطقة القطع الحذوي" ، ومنطقة صغيرة تحيط بالبويضة لاستخدامها في طرح الخلفية بالنقر فوق "منطقة مستطيلة". قم بتصدير بيانات قياس المنطقة إلى جدول بيانات بالنقر فوق "فتح السجل" ثم "سجل البيانات".

لكل بويضة فردية ولجميع النقاط الزمنية المقاسة، اطرح قياس منطقة الخلفية من قياس منطقة البويضة بشكل منفصل للأطوال الموجية YFP و mCheric.