اختبار مراسل البويضة المفردة في المختبر: تقنية لدراسة تنظيم ترجمة الرنا المرسال المستهدف أثناء نضوج البويضات في المختبر

البويضات في الطور الأول من الانقسام الاختزالي نشطة من الناحية النسخية؛ فهي تنتج الرنا المرسال وتخزنها في شكل نائم. أثناء النضج ، عندما تدخل البويضة في الطور ، تترجم mRNAs المخزنة إلى بروتينات.

لدراسة ترجمة mRNA ، ابدأ ببويضات الفأر المعتقلة من الطور الأول المعلقة في قطرة من الوسط. ضع الماصة المثبتة بالقرب من بويضة واحدة لتثبيتها في موضعها.

خذ ماصة حقن دقيقة تحتوي على مزيج مراسل. يحتوي هذا المزيج على نوعين متميزين من mRNA ، أحدهما يشفر بروتين الفلورسنت الأصفر ، أو YFP - مراسل مدمج مع المنطقة 3'-غير المترجمة من الجين المستهدف - و mRNA متعدد الأدينيل يشفر بروتين الفلورسنت الأحمر.

حقن مزيج المراسل في البويضة. احتضان البويضات المحقونة الدقيقة في وسط نضج مكمل بسيلوستاميد - مثبط كيميائي يحافظ على توقف الطور الأول.

تترجم البويضة mRNA متعدد الأدينيل حتى تصل شدة التألق الأحمر إلى هضبة ، بينما تظل مستويات mRNA المشفر YFP التي تفتقر إلى ذيل بولي الأدينيل على هذا النحو.

انقل البويضات المعالجة إلى وسط نضج بدون سيلوستاميد ، مما يساعد على استئناف الانقسام الاختزالي ؛ ويخضع الرنا المرسال المستهدف للترجمة لإنتاج البروتين المستهدف المدمجة مع مراسل الفلورسنت الأصفر.

قم بإجراء تصوير بفاصل زمني لتصور إشارات التألق على فترات منتظمة.

تظهر البويضات المحقونة مستويات ثابتة من التألق الأحمر ، بينما يزداد التأ