فحص البروتين القابل للذوبان لتحديد محتوى البروتين القابل للذوبان في الأنسجة النباتية

لتحديد محتوى البروتين القابل للذوبان في الأنسجة النباتية ، في أنبوب ، ابدأ بكمية مناسبة من الأنسجة النباتية المطحونة المجففة.

أضف هيدروكسيد الصوديوم ، وهو قلوي ، إلى الأنبوب وصوتي. تعمل البيئة القلوية ذات القوى الميكانيكية على تعطيل الخلايا ، وتطلق محتويات داخل الخلايا ، بما في ذلك الجزيئات الكبيرة - البروتينات القابلة للذوبان والكربوهيدرات. احتضان في درجات حرارة أعلى.

في وجود الحرارة ، تسبب القلويات التحلل المائي للبروتين ، وتشكل ببتيدات أصغر وتزيد من قابلية ذوبان البروتين. بالإضافة إلى ذلك ، تتحلل الكربوهيدرات.

الطرد المركزي الخليط. اجمع المادة الطافية المحتوية على البروتين المذاب. أضف حمض الهيدروكلوريك لتحييد درجة الحموضة.

عالج العينة بحمض ثلاثي كلورو أسيتيك ، TCA. يعطل TCA قشرة الترطيب المحيطة بالبروتينات ، مما يؤدي إلى تراكم البروتين وهطول الأمطار.

جهاز طرد مركزي وإزالة المادة الطافية المحتوية على TCA. اغسل حبيبات البروتين بالأسيتون المثلج لإزالة أي بقايا TCA, والتي قد تتداخل مع تقدير البروتين القابل للذوبان.

جفف الأسيتون بالهواء. أعد تعليق حبيبات البروتين في هيدروكسيد الصوديوم. خفف بالماء منزوع الأيونات. نقل إلى آبار لوحة متعددة الآبار.

أضف محلولا حمضيا من صبغة Coomassie Brilliant Blue G-250. في ظل الظروف الحمضية ، ترتبط الصبغة ببقايا الأحماض الأمينية الأساسية في البروتينات القابلة للذوبان ، مما ينتج عنه مركب صبغة البروتين الأزرق.

استخدم مقياس الطيف الضوئي لقياس امتصاص مركب صبغة البروتين ، بما يتناسب مع محتوى البروتين القابل للذوبان في الأنسجة النباتية.

للبدء ، قم بوزن العينات المكررة من كل نسيج في أنابيب طرد مركزي دقيقة سعة 1.5 ملليلتر. بعد ذلك ، سجل الكتلة الدقيقة لكل عينة. باستخدام ماصة دقيقة، أضف 500 ميكرولتر من هيدروكسيد الصوديوم 0.1 مولار إلى كل أنبوب. أغلق الأغطية بإحكام ، وقم بصوتنة الأنابيب لمدة 30 دقيقة.

بعد ذلك ، ضع الأنابيب في حمام ماء ساخن مسخن مسبقا لمدة 15 دقيقة. بعد ذلك ، قم بالطرد المركزي للأنابيب عند 15,000 جم لمدة 10 دقائق. ماصة المادة الطافية في أنابيب أجهزة الطرد المركزي الدقيقة الجديدة ذات العلامات التجارية باستخدام طرف ماصة جديد لكل عينة.

أضف 300 ميكرولتر من هيدروكسيد الصوديوم 0.1 مولار إلى الحبيبات ، وكرر الطرد المركزي لمدة 10 دقائق. بعد ذلك ، قم بإزالة المادة الطافية ، وانقله إلى الأنابيب التي تحتوي على المادة الطافية من الطرد المركزي الأول.

لتحييد درجة الحموضة للطافي ، أضف 11 ميكرولترا من حمض الهيدروكلوريك المولاري 5.8. استخدم ورق عباد الشمس للتأكد من أن الرقم الهيدروجيني هو 7 تقريبا.

بعد ذلك ، أضف 90 ميكرولترا من حمض ثلاثي كلورو أسيتيك بنسبة 100٪ إلى كل أنبوب. ثم احتضان الأنابيب على الجليد لمدة 30 دقيقة. الطرد المركزي للعينات عند 13,000 غرام لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية. بعناية ، استخدم خطا مفرغا وطرف ماصة زجاجية لإزالة حمض ثلاثي كلورو أسيتيك.

احرص على عدم إزعاج الحبيبات بطرف الشفط.

بعد ذلك ، اغسل الحبيبات ب 100 ميكرولتر من الأسيتون المبرد إلى سالب 20 درجة مئوية. ثم اترك الأسيتون يتبخر في غطاء الدخان. قم بإذابة حبيبات البروتين مع 1 مليلتر من هيدروكسيد الصوديوم. قد تكون هناك حاجة إلى جولات إضافية من التدفئة والدوامة والصوتنة.

أضف 160 ميكرولترا من كل محلول قياسي IgG إلى لوحة مكونة من 96 بئرا في ثلاث نسخ ، بدءا من الموضع A1. بعد ذلك ، في أنبوب جديد سعة 1.5 مليلتر ، أضف 50 ميكرولترا من كل محلول عينة إلى 950 ميكرولتر من الماء المقطر. بعد ذلك ، أضف 60 ميكرولترا من كل عينة مخففة إلى لوحة البئر في ثلاث نسخ ، بدءا من موضع H1. أضف 100 ميكرولتر من الماء المقطر إلى جميع آبار العينات الفارغة وغير المعروفة.

باستخدام ماصة متعددة القنوات، أضف 40 ميكرولترا من صبغة بروتين G-250 ذات اللون الأزرق اللامع من Coomassie إلى كل بئر من اللوحة. باستخدام إبرة ، قم بتفجير أي فقاعات موجودة في الآبار. بعد ذلك ، اترك اللوحة تحتضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق. بعد ذلك ، استخدم مقياس الطيف الضوئي المجهري لتسجيل قيم الامتصاص لكل بئر عند 595 نانومتر.