مقايسة النمو القائمة على لوسيفيراز لتحديد تكاثر الطفيليات داخل الخلايا

التوكسوبلازما جوندي - أوليات وحيدة الخلية - هي طفيلي لاهوائي إلزامي ، يتكاثر فقط داخل الخلايا المضيفة.

لتحديد نمو الطفيلي داخل الخلايا باستخدام مقايسة قائمة على لوسيفيراز ، خذ تعليقا لخلايا الطفيليات التي تعبر عن لوسيفيراز - إنزيم ينتج لمعانا عند التفاعل مع ركيزته. أضف المعلق إلى ثقافة الخلايا الليفية للقلفة البشرية ، واحتضن لمدة كافية.

يرتبط الطفيل بمستقبلات الخلايا المضيفة ويتم استيعابه من خلال عملية داخلية ، مكونا فجوة طفيلية. يوفر الهيكل مكانا مناسبا لتكاثر الطفيلي.

بعد الإصابة ، استنشق الوسط ، وإزالة الطفيليات غير الداخلية. أضف عازلة تحلل تحتوي على منظف ولوسيفيرين - ركيزة لوسيفيراز. يخلق المنظف الموجود في المخزن المؤقت مساما في غشاء الخلية ويعمل على تحلل الخلايا تماما ، مما يؤدي إلى إطلاق لوسيفيراز.

يؤكسد الإنزيم الذي تم إطلاقه جزيئات اللوسيفيرين ، وينبعث منه الضوء. قياس شدة اللمعان لتحديد نشاط لوسيفيراز. باستخدام الآبار المكررة التي تحتوي على خلايا مضيفة مصابة ، قم بقياس نشاط لوسيفيراز على فترات محددة مسبقا بعد الإصابة.

ارسم شدة التلألؤ الطبيعي مقابل الفترات الزمنية للحصول على تغييرات الطية في نمو الطفيليات بمرور الوقت. يشير الارتفاع الزمني في الشدة إلى نجاح تكاثر الطفيليات.

ارسم القيم في مقياس لوغاريتمي لحساب ميل المنحنى ، مما يمثل وقت مضاعفة الطفيلي.

لإجراء مقايسة نمو التوكسوبلازما القائمة على لوسيفيراز ، ابدأ بشفط الوسط بعناية من مزارع الصفيحة الدقيقة المكونة من 96 بئر من الخلايا الليفية للقلفة البشرية ، وتلقيح 150 ميكرولترا من المعلق الخالي من الطفيليات في الآبار بتنسيق من ثلاثة أعمدة وخمسة صفوف.

بعد حضانة لمدة أربع ساعات في حاضنة زراعة الخلايا ، قم بشفط الوسط بعناية من كل بئر لإزالة الطفيليات غير المغزوة ، واملأ الآبار في كل صف ما عدا الصف الأول بوسط خال من الفينول بدرجة حرارة الغرفة. بعد ذلك ، أضف 100 ميكرولتر من محلول ركيزة لوسيفيراز 12.5 ميكرومولار في PBS في كل بئر من الصف العلوي ، واحتضن الصفائح الدقيقة لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة للسماح بتحلل الخلية الكامل.

في نهاية الحضانة ، قم بقياس نشاط لوسيفيراز على قارئ صفيحة دقيقة. تمثل كل قراءة العدد الأولي للطفيليات التي تم غزوها بعد أربع ساعات من الإصابة. كرر التحليل كل 24 ساعة للأيام الأربعة التالية دون تغيير الوسيط.

لحساب تغير الطية الطبيعي لنمو الطفيليات ، يمكن تقسيم كل قراءة على القراءة الأولية بعد أربع ساعات من الإصابة. يمكن بعد ذلك رسم log2 لتغيير الطية الطبيعي لنمو الطفيليات مقابل كل نقطة زمنية ، وإخضاعها لوظيفة انحدار خطي للحصول على المنحدر ، والذي يمثل وقت المضاعفة.