موسوعة JoVE للتجارب
التقنيات البيولوجية
0 مشاهدة • 4:14 دقيقة • July 8th, 2025
Msp1 ، وهو ATPase في الغشاء الخارجي للميتوكوندريا ، يزيل البروتينات غير الموضعية ، أو TA ، من الغشاء عبر المسام المركزية السداسية ، مما يسهل تدهورها.
لفهم آلية الإزاحة ، قم بإعادة تكوين بروتينات TA ، و Msp1 في الجسيمات الشحمية ، مما يتيح دمجها في الطبقة الدهنية الثنائية.
قم بإعداد مزيج تفاعل عن طريق إضافة الجسيمات الشحمية المعاد تكوينها إلى مخزن مؤقت مناسب يحتوي على مرافقين - بروتينات التحكم في جودة العصارة الخلوية. يتم تمييز المرافقين بإنزيم الجلوتاثيون-S-transferase أو GST.
أضف أدينوسين ثلاثي الفوسفات - ATP - إلى التفاعل. يرتبط Msp1 بجزيئات ATP ويتحللها. باستخدام الطاقة المتولدة بالتحلل المائي ، يقوم Msp1 بنقل بروتينات TA المرتبطة بالغشاء من خلال مسامها المركزية. ترتبط المرافقات في مزيج التفاعل بمجال الغشاء لبروتينات TA المستخرجة.
بعد ذلك ، قم بتحميل مزيج التفاعل على عمود تنقية التقارب. يحتوي العمود على راتنج مترافق مع انخفاض الجلوتاثيون أو GSH. يرتبط بروتين GST الموجود على المرافقين ب GSH المترافق - الركيزة - ويربط مجمعات بروتين المرافق TA بالراتنج.
قم بتدوير العمود لإزالة بروتينات TA التي لا تزال مدمجة في الجسيمات الشحمية. الآن ، أضف مخزن مؤقت للشطف يحتوي على فائض من GSH. تحل جزيئات GSH الحرة بشكل تنافسي محل الارتباط بين GST و GSH المترافقة.
قم بالتخلص من مجمعات بروتين المرافق
اعرض النص الكامل واحصل على الوصول إلى آلاف الفيديوهات العلمية