اختبار قائم على اللوحة لقياس إطلاق أحادي الأمين من شرائح الدماغ عند اختبار التعرض للأدوية

الناقلات العصبية أحادية الأمين ، الرسل الكيميائي الداخلي ، تنقل الإشارات عبر المشبك ، نقطة الاتصال بين الخلايا العصبية. نظام الناقل العصبي أحادي الأمين المنظم بإحكام ضروري لوظيفة الخلايا العصبية الطبيعية.

لفحص تأثير دواء الاختبار على إطلاق أحادي الأمين خارج الجسم الحي ، احصل على شرائح أنسجة دماغ الفئران التي تحتوي على منطقة الاهتمام في مخزن مؤقت مؤكسج مبرد ، مما يحافظ على بقاء الأنسجة.

انقل شرائح الأنسجة إلى آبار صفيحة متعددة الآبار ، مع إدخالات مرشح مسامية متصلة بإمداد خليط غازي وتتكون من السائل الدماغي النخاعي الاصطناعي المؤكسج ، aCSF ، مكمل بمثبطات أوكسيديز أحادي الأمين. حضن.

تنتشر المثبطات في الخلايا وتعطل إنزيمات أوكسيديز أحادي الأمين ، مما يمنع تحلل أحادي الأمين ويزيد من تركيزها المتاح للتخزين والإفراج.

نقل الإدخالات المحتوية على الأنسجة إلى الآبار التي تشتمل على aCSF المؤكسج ، وعقار الاختبار. حضن. قد يحفز الدواء نظام الناقل العصبي أحادي الأمين ، مما يزيد من تركيز أحادي الأمين في الفضاء الخارجي للخلايا العصبية ، مما يؤدي إلى إطلاقها من أنسجة المخ إلى المحلول.

تمر أحاديات الأمين التي تم إطلاقها عبر الإدخالات المسامية إلى الآبار ، وتنفصل عن الأنسجة.

بعد الحضانة ، قم بإزالة الحشوات التي تحتوي على شريحة الأنسجة. اجمع محلول أحادي الأمين في أنبوب يتكون من مذيب متوافق مع كروماتوغرافيا السائل عالية الأداء ، HPLC. انقل محتويات الأنبوب إلى وحدات تصفية مجمعة مسبقا. أجهزة الطرد المركزي ، وإزالة الملوثات الرئيسية.

قم بتحميل المرشح الذي تم الحصول عليه في عمود HPLC وقم بإجراء تشغيل كروماتوغرافيا لتحديد تركيز أحادي الأمين ، مما يدل على تأثير دواء الاختبار على إطلاق أحادي الأمين.

للحث على إطلاق أحادي الأمين ، انقل عينات الأنسجة إلى كل بئر من غرفة التدفق المكونة من 48 بئرا ، والتي تحتوي على 0.5 إلى 1 مليلتر من مخزن التدفق لكل بئر مع فقاعات ثابتة ولطيفة ، واسمح للعينات بالتعافي لمدة 30 إلى 50 دقيقة عند 37 درجة مئوية.

في نهاية فترة التوازن ، انقل حامل الأنسجة مع أنسجة المخ ، إلى آبار تحتوي على 500 ميكرولتر من مخزن التدفق المؤكسج مع أو بدون عامل دوائي ، والنقر على الحامل الموجود على حافة البئر لمنع الحد الأدنى من نقل المخزن المؤقت بين الآبار ، لمدة 20 دقيقة عند 37 درجة مئوية.

في نهاية الحضانة ، انقل الحامل إلى مجموعة جديدة من الآبار تحتوي على 500 ميكرولتر من مخزن التدفق مع أو بدون الدواء المعني ، وأعد اللوحة إلى حاضنة زراعة الخلايا ، لمدة 20 دقيقة إضافية.

أثناء الحضانة الثانية ، انقل المحلول من الآبار من الحضانة الأولى إلى أنابيب الطرد المركزي الدقيقة التي تحتوي على 50 ميكرولتر من 1 نيوتن بيركلوريك أو حمض الفوسفوريك على الجليد ، وقم بتسمية الأنابيب # 1.

في نهاية الحضانة الثانية ، انقل حامل الأنسجة إلى آبار فارغة مع وضع الصفيحة على الجليد ، وانقل المواد الطافية من الحضانة الثانية إلى أنابيب الطرد المركزي الدقيقة الجديدة التي تحتوي على 50 ميكرولترا من حمض البيركلوريك أو الفوسفوريك 1 نيوتن ، على الجليد. قم بتسمية هذه الأنابيب # 2.

عندما يتم نقل جميع المواد الطافية ، أضف 1 مليلتر من محلول تشريح الثلج البارد إلى كل بئر من الأنسجة ، واستخدم ملاقط صغيرة لنقل كل عينة من الأنسجة إلى أنبوب طرد مركزي دقيق جديد. قم بإزالة المخزن المؤقت من أنابيب العينة ، وقم بتخزين الأنسجة عند -80 درجة مئوية. بعد ذلك ، قم بنقل محاليل الحضانة المجمعة إلى أنابيب ترشيح أجهزة الطرد المركزي الدقيقة للطرد المركزي ، ووضع المرشح على الجليد ، حتى تحليل HPLC.