JoVE Encyclopedia of Experiments
التقنيات البيولوجية
0 مشاهدات • 2:52 د • July 8th, 2025
تحتوي وريقات الصمام الأبهري على مجموعة غير متجانسة من الخلايا الخلالية للصمام، أو VICs، موزعة في جميع أنحاء طبقات المصفوفة خارج الخلية. عند التحفيز ، تتحول VICs إلى بانيات العظم - خلايا مكونة لمصفوفة العظام.
تفرز بانيات العظم الناضجة الكولاجين وبروتينات مصفوفة العظام. تساعد هذه البروتينات بانيات العظم على الالتصاق بالمصفوفة. أخيرا ، تدخل أيونات الكالسيوم داخل الخلايا إلى بيئة المصفوفة ، وتترسب إلى جانب الفوسفات كعقيدات معدنية ، مما يؤدي إلى تكلس الصمام الأبهري.
لتقييم تركيز الكالسيوم في الصمامات الأبهرية المتكلسة ، ابدأ بزراعة VICs في صفيحة من ستة آبار. تخلص من وسط الاستزراع ، وأضف وسيطا عظميا في البئر ، واحتضن.
أثناء الحضانة ، يحفز الأنسولين الموجود في وسط العظم VICs على التمايز إلى أنماط ظاهرية للعظام. تفرز بانيات العظم هذه بروتينات مصفوفة العظام وحمض الأسكوربيك في وسط العظم مما يدفعها إلى تكوين مصفوفة خارج الخلية غنية بالكولاجين.
أخيرا ، يشكل الكالسيوم داخل الخلايا وفوسفات الوسط بلورات معدنية في الوسط.
قم بإزالة الوسط وأضف محلول حمض الهيدروكلوريك. احتضان لإذابة أيونات الكالسيوم في المحلول. قم بتوزيع الوسط الحمضي الذي يحتوي على الكالسيوم في بئر صفيحة متعددة الآبار.
أضف صبغة حساسة للكالسيوم واحتضنها. ترتبط جزيئات الصبغة بأيونات الكالسيوم في الوسط الحمضي ، وتشكل مركبا صبغيا أرجوانيا للكالسيوم.
قياس امتصاص المركب الذي يتناسب مع تركيز الكالسيوم في العينة.
قبل البدء في الفحص ، قم بتنظيف غطاء السلامة الحيوية بنسبة 70٪ من الإيثانول ، وقم بتسخين وسط DMEM إلى 37 درجة مئوية. بعد ذلك ، قم بزرع 100,000 خلية لكل حالة في ألواح مكونة من 6 آبار في DMEM كامل ، والزراعة عند 37 درجة مئوية.
بعد 24 ساعة ، استبدل الوسط الطافي بوسط التكلس ، واحتضان الخلايا لمدة 7 أيام عند 37 درجة مئوية ، واستبدل الوسط في اليوم الثالث.
بعد 7 أيام ، قم بقياس تركيز الكالسيوم في صفيحة مكونة من 96 بئرا باستخدام كاشف Arsenazo III ، وتسجيل الامتصاص عند 650 نانومتر.