JoVE Encyclopedia of Experiments
التقنيات البيولوجية
0 مشاهدات • 4:57 د • July 8th, 2025
في أسماك الزرد ، تسبب الجسيمات الدقيقة المحيطة ، أو PM - أحد ملوثات الهواء - خلل في القلب الناجم عن الإجهاد التأكسدي.
لدراسة تأثير الجسيمات الجسيمية على أسماك الزرد ، ابدأ بتعريض أجنة أسماك الزرد للمواد العضوية القابلة للاستخراج المشتقة من PM ، EOM ، والتي تؤدي إلى توليد أنواع الأكسجين التفاعلية ، أو ROS.
يؤكسد ROS الجوانين الأساسي للحمض النووي إلى 8-hydroxy-2′-deoxyguanosine أو 8-OHdG ويتسبب في فسفرة هيستون H2AX لتشكيل γH2AX - علامة لفواصل الحمض النووي المزدوج.
بعد التعرض ، قم بتشريح قلب الزرد وضعه على شريحة زجاجية. عالج القلب بمحلول مثبت يربط البروتينات ، مما يؤدي إلى استقرار البنية الخلوية.
بعد ذلك، أضف كاشف حظر لمنع مواقع الربط غير المحددة. أضف الأجسام المضادة الأولية التي تستهدف γH2AX و 8-OHdG في خلايا القلب.
بعد ذلك ، أضف جسمين مضادين ثانويين مختلفين اللون يحملان علامة الفلورسنت يرتبطان على وجه التحديد بمنطقة Fc للجسم المضاد الأساسي الخاص بهما. أخيرا ، قم بتلطيخ العينة ب DAPI - وهي بقعة خاصة بالحمض النووي - ترتبط بالأخدود الثانوي للتسلسلات الغنية ب AT في الحمض النووي لتشكيل مركب فلورسنت.
ضع الشريحة تحت المجهر الفلوري لمراقبة الإشارات من تعبير 8-OHdG و γH2AX في قلوب أجنة الزرد المعالجة ب EOM.
تشير شدة التألق العالية بشكل ملحوظ من خلايا القلب إلى تلف الحمض النووي التأكسدي الناجم عن EOM وفواصل الخيط المزدوج.
استخدم قلم حاجز مسعور لرسم دائرة على شريحة زجاجية نظيفة. أضف 50 ميكرولترا من 4٪ بارافورمالدهايد إلى 1.25 ميكرولتر من PBS لعمل محلول تثبيتي. بعد ذلك ، ضع ثلاثة قلوب مقطوعة في دائرة حاجز واحدة كارهة للماء ، واحتضنها لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
صب المحلول تحت المجهر ، وجفف العينات في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق على الأقل. اغسل الشرائح ثلاث مرات في PBST لمدة 5 دقائق لكل غسلة. أضف 50 ميكرولترا من BSA إلى 1,000 ميكرولتر من PBST للحصول على محلول BSA بنسبة 5٪ ، واحتضان الشرائح في غرفة رطبة لمدة ساعة واحدة لمنع ارتباط الأجسام المضادة غير المحددة.
صب المحلول ، وغسل العينات ثلاث مرات باستخدام PBS لمدة 5 دقائق لكل غسلة. قم بتخفيف ميكرولترين من الجسم المضاد أحادي النسيلة للفأر ضد 8-hydroxy-deoxyguanosine ، وميكرولترين من الأجسام المضادة متعددة النسيلة للأرانب ضد gamma-H2AX في 296 ميكرولتر من PBST ، للحصول على محلول كوكتيل أساسي للأجسام المضادة.
احتضان عينات القلب ب 50 ميكرولتر من محلول كوكتيل الأجسام المضادة الأولي ، في غرفة مرطبة لمدة ساعة واحدة على الأقل في درجة حرارة الغرفة أو بين عشية وضحاها عند 4 درجات مئوية.
صب المحلول ، وغسل العينات ثلاث مرات باستخدام PBST لمدة 5 دقائق لكل غسلة. قم بتخفيف 1 ميكرولتر من الجسم المضاد الثانوي للماعز المضاد للفأر المسمى FITC ، و 1 ميكرولتر من الجسم المضاد الثانوي للماعز cy3 المضاد للأرانب في 500 ميكرولتر من PBST للحصول على محلول كوكتيل ثانوي للأجسام المضادة.
احتضان العينات بالأجسام المضادة الثانوية لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة في الظلام.
صب المحلول ، وغسل العينات ثلاث مرات باستخدام PBS لمدة 5 دقائق لكل غسلة. أضف 20 ميكرولترا من DAPI إلى عينات التلوين النووي ، واحتضنها لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. ضعي غطاء على الشريحة وأغلقيها بطلاء الأظافر لمنع الجفاف والحركة.
قم بتصوير العينات تحت المجهر الفلوري ، وحدد إشارة الفلورسنت لمنطقة القلب باستخدام برنامج ImageJ. احسب التغييرات النسبية باستخدام متوسط عينات التحكم في DMSO ، وحدد الدلالة الإحصائية للبيانات.