فحص الجرح لتقييم القدرة المهاجرة للأرومات العضلية الفئرانية في الزراعة المشتركة

استجابة للجرح ، تنتج الخلايا الإفرازية جزيئات إشارات باراكرين لتنشيط الخلايا العضلية - خلايا عضلية غير متمايزة. تهاجر الأرومات العضلية المنشطة نحو موقع الجرح ، حيث تتكاثر ، مما يؤدي إلى التئام الجرح.

لتقييم القدرة على هجرة الأرومات العضلية في المختبر ، خذ صفيحة متعددة الآبار تحتوي على طبقة أحادية التقاء من الخلايا العضلية الفئرانية. باستخدام طرف الماصة، قم بخدش الطبقة الأحادية لإنشاء رقعة خطية خالية من الخلايا داخل البئر، والتي تحاكي موقع الجرح.

استكمل البئر بعناية بوسط النمو دون إزعاج رقعة الجرح.

خذ حشوة غشائية تحتوي على مزرعة ملتصقة لخلايا القمة العصبية ، أو الخلايا العصبية العصبية - الخلايا الإفرازية - في وسط مناسب. ضع الملحق داخل البئر ، بحيث تكون NCCs في القاعدة بالقرب من رقعة الجرح. احتضان الثقافة المشتركة للمدة المطلوبة.

أثناء الحضانة ، تطلق الخلايا الصلبة الصافية جزيئات إشارات ترتبط بالمستقبلات المحددة على الأرومات العضلية ، مما يؤدي إلى سلسلة إشارات. تسهل هذه الإشارات إعادة تنظيم الأكتين في الأرومات العضلية ، ونتيجة لذلك ، تطور هذه الخلايا إسقاطات سيتوبلازمية مثل الصفيحة والأشرطة الخيطية ، عند حوافها. تساعد هذه الإسقاطات الأرومات العضلية على الهجرة نحو المنطقة المصابة وإعادة توطينها تدريجيا ، مما يؤدي إلى التئام الجروح.

ضع اللوحة تحت المجهر ، ولاحظ التئام الجروح ، والذي يرتبط مداه بالقدرة على هجرة الأرومات العضلية في الزراعة المشتركة.

عندما تصل الخلايا إلى التقاء 70٪ إلى 80٪ ، قم بإزالة الوسط الطافي من غرفة C2C12 جيدا ، واغسل الخلايا مرة واحدة باستخدام PBS.

بعد إزالة PBS ، ابدأ في خدش الخلايا عن طريق تمرير طرف ماصة P10 معقم بإحكام ، في اتجاه واحد ليمتد طوال أو عرض الطبقة الأحادية للخلية. بمجرد خدش الخلايا ، أضف بسرعة 1 مليلتر من PBS.

بعد ذلك ، قم بتشغيل الكمبيوتر والمجهر. ضع شريحة الغرفة على المسرح، وقم بتدوير قرص الهدف إلى تكبير 5X. افتح برنامج التصوير، وانقر فوق علامة التبويب "الكاميرا"، ثم انقر فوق الزر "مباشر" لتصور الخلايا في علامة التبويب "AxioCam IC".

تأكد من سحب مرشح الضوء بالكامل للسماح للضوء بالمرور إلى الكاميرا وشاشة الكمبيوتر. حرك شريحة الغرفة أو قم بتدويرها يدويا لوضع منطقة الجرح في وسط الصورة الحية في علامة التبويب "AxioCam IC". لالتقاط الصور ، انقر فوق "Snap" لفتح علامة التبويب "جديد" بجوار علامة التبويب "AxioCam IC" التي تحتوي على الصورة.

لحفظ هذه الصورة الثابتة ، انقر فوق "ملف" ، وحدد "حفظ باسم" ، وحدد "سطح المكتب" على الشريط الموجود على اليسار لحفظ الملف على سطح المكتب. أدخل "اسم الملف" في مربع اسم الملف ، واحفظ الشكل بتنسيق الملف ".czi".

لحفظ الصورة بتنسيق ".tiff" ، انقر فوق "ملف" ، وحدد "حفظ باسم" ، وأدخل "اسم الملف" في مربع اسم الملف ، وانقر فوق الزر "حفظ حسب النوع" ، وحدد "* .tiff" من القائمة المنسدلة.

أعد وضع شريحة الغرفة يدويا لالتقاط صورتين إلى ثلاث صور أخرى في نقاط أخرى من الجرح في نفس البئر. بعد التصوير ، قم بإزالة PBS من كل بئر ، وأضف 1 مليلتر من وسط C2C12.

قم بتجميع نظام الزراعة المشتركة لإدخال البئر عن طريق وضع الإدخالات التي تحتوي على خلايا O9-1 يدويا في كل بئر من بئر الغرفة. برفق ، ادفع الإدخالات لأسفل في البئر بحيث يكون الجزء السفلي من الإدخال أعلى خلايا C2C12 الأساسية مباشرة. أعد تركيبات إدخال البئر إلى الحاضنة ، واسمح للخلايا بالترحيل لمدة 9 إلى 12 ساعة.

لتحديد وقت الهجرة الأمثل ، افحص الخلايا بعد ست ساعات من تكوين الجرح ، ثم كل ساعتين إلى ثلاث ساعات بعد ذلك. قم بإنهاء التجربة عندما تغطي الخلايا في ظروف التحكم الجرح بالكامل.