فحص المذنب للكشف عن تلف الحمض النووي في الخلايا

التعرض للعوامل الضارة إلى حدوث فواصل أحادية ومزدوجة الشريطة في الحمض النووي الخلوي ، مما يؤدي إلى تلف الحمض النووي.

للكشف عن تلف الحمض النووي ، ابدأ بتعليق خلية واحدة من الخلايا المعالجة كيميائيا في agarose المسال ونقطة الانصهار المنخفضة. قم بتحميل المعلق على شريحة زجاجية ، واترك الاغاروز يتجمد - مما يتيح تثبيت الخلايا داخل مصفوفة الهلام المسامية.

عالج الخلايا بمحلول التحلل. تعمل المنظفات الموجودة في المخزن المؤقت على إذابة الأغشية الخلوية والنووية ، بينما تزيل الأملاح الهستونات من الحمض النووي ، وتشكل جسما نوويا يحتوي على الحمض النووي المتصل بالمصفوفة النووية.

احتضان الشرائح في مخزن مؤقت للرحلان الكهربائي القلوي. يؤدي هذا إلى استرخاء الحمض النووي وتوليد شظايا أحادية الشريطة. ضع الشريحة في جهاز الرحلان الكهربائي ، وقم بتوصيلها بمصدر الطاقة. هذا يسمح بهجرة الحمض النووي سالب الشحنة نحو الأنود الموجب.

يظل الحمض النووي غير التالف مقيدا داخل الجسم النووي. في المقابل ، تبدأ شظايا الحمض النووي الأصغر والتالفة في التحرك نحو الأنود. تشكل هذه الحركة التفاضلية بنية تشبه المذنب ، حيث يشكل الحمض النووي غير التالف الرأس ، بينما يشكل الحمض النووي التالف ذيل المذنب.

احتضان الشريحة في مخزن مؤقت للتحييد للسماح لشظايا الحمض النووي أحادية الشريطة بإعادة تشكيلها. بعد ذلك ، عالج الشريحة بصبغة فلورية تلطخ الحمض النووي. تصور الشريحة تحت المجهر الفلوري.

ترتبط شدة الذيل وطوله بدرجة تلف الحمض النووي الخلوي.

للبدء ، قم بإعداد 0.6٪ من نقطة انصهار منخفضة من agarose في PBS ، وضعها في حمام مائي عند 37 درجة مئوية. تم تسمية الطرف المصنفر للشرائح المطلية مسبقا بالاسم والتاريخ ومعلومات العلاج باستخدام قلم تحديد أو قلم رصاص دائم.

ضع لوحا تقشعر له الأبدان على مقعد مسطح ، وأدخل عبوتين من التبريد المجمدة في الدرج المنزلق أسفل السطح المعدني. ثم ضع الشرائح على طبق التبريد لتبرد مسبقا لمدة 1 إلى 2 دقيقة. جهاز الطرد المركزي وإزالة المادة الطافية من أنابيب العينة ، ووضعها على الفور مرة أخرى على الجليد. أعد تعليق حبيبات الخلية ب 200 ميكرولتر من 0.6٪ من الاغاروز نقطة انصهار منخفضة ، واخلطها عن طريق سحب العينات.

بعد ذلك ، أضف 80 ميكرولترا من الخلايا المحتوية على الاغاروز على شريحة مبردة ، ثم ضع غطاء على الجل بسرعة. اترك الجل يتماسك على طبق التبريد لمدة 1 إلى 2 دقيقة. في غضون ذلك ، قم بإعداد 500 مل من محلول العمل من عازلة التحلل ، واسكبه في طبق التحلل.

بعد أن يتم تثبيت المواد الهلامية ، قم بإزالة الغطاء بسرعة عن طريق إمساك الشريحة برفق بين الإبهام والسبابة ، وتحريك الغطاء من الجل. بعد ذلك ، ضع الشرائح داخل حامل للشرائح ، بحيث تكون جميع علامات النقاط السوداء على الشرائح متجهة في نفس الاتجاه. ضع حامل الشريحة داخل طبق التحلل. أغلق غطاء طبق التحلل وضعه للحضانة.

قم بإزالة حامل الشريحة بعناية من طبق التحلل دون إزعاج المواد الهلامية. برفق ، ضع حامل الشرائح في طبق غسيل محمل مسبقا بالماء المقطر المزدوج المثلج. تأكد من غمر الشرائح بالكامل ، واترك الإعداد لمدة 30 دقيقة.

ضع عبوة تبريد مجمدة أسفل خزان الرحلان الكهربائي للحفاظ على درجة الحرارة العازلة المثلى. بعد ذلك ، أضف محلول عمل الرحلان الكهربائي المثلج إلى الخزان ، وانقل حامل الشريحة إليه. قم بتوجيه الشرائح بحيث تشير الخلية التي تحتوي على المواد الهلامية نحو الكاثود.

احتضان الشرائح في خزان الرحلان الكهربائي لمدة 20 دقيقة ، للسماح للحمض النووي بالاسترخاء. بعد ذلك ، قم بتشغيل مصدر الطاقة لإجراء الرحلان الكهربائي لمدة 20 دقيقة بمعدل 1.19 فولت لكل سنتيمتر. بعد اكتمال الرحلان الكهربائي ، قم بإيقاف تشغيل مصدر الطاقة ، وقم بإزالة حامل الشريحة من خزان الرحلان الكهربائي. اترك حامل الشريحة يجف على المناديل الورقية لمدة 30 ثانية.

بعد ذلك ، ضع حامل الشرائح في طبق يحتوي على مخزن مؤقت للتحييد ، واتركه لمدة 20 دقيقة. بعد ذلك ، ضعه في طبق غسيل يحتوي على ماء مقطر مزدوج بارد ، واتركه لمدة 20 دقيقة. بعد الغسيل ، قم بإزالة حامل الشريحة من الماء ، واترك الشرائح تجف في حاضنة عند 37 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة.

لإعادة ترطيب الشرائح ، انقل حامل الشرائح إلى طبق غسيل يحتوي على ماء مقطر مزدوج بارد واتركه لمدة 30 دقيقة. بعد ذلك ، ضع حامل الشريحة في طبق تلطيخ يحتوي على 2.5 ميكروغرام لكل مليلتر من محلول يوديد البروبيديوم.

أغلق غطاء طبق التلوين ، واحتضنه لمدة 20 دقيقة في الظلام في درجة حرارة الغرفة. بعد الحضانة ، انقل حامل الشريحة إلى طبق منفصل ، واغسله بالماء المقطر المزدوج المثلج لمدة 20 دقيقة.

قم بإزالة حامل الشريحة من الطبق وجففه تماما في الظلام ، إما في حاضنة 37 درجة مئوية أو في درجة حرارة الغرفة. بعد أن تجف الشرائح تماما ، قم بتخزينها في صندوق شرائح في الظلام حتى تصبح جاهزة لتحليل الصور.