JoVE Encyclopedia of Experiments
التقنيات البيولوجية
0 مشاهدات • 4:04 د • July 8th, 2025
ناقلات الأحماض الأمينية هي بروتينات مرتبطة بالغشاء تتوسط نقل الأحماض الأمينية عبر أغشية الخلايا ، وتنظم العمليات الخلوية الحيوية.
لدراسة امتصاص الأحماض الأمينية في المختبر ، خذ مزرعة الخلايا اللحمية المشتقة من نخاع عظم الفأر. شفط وسط النمو. أضف عازلة مسخنة مسبقا مكملة بالجلوتامين — حمض أميني — مسمى بالهيدروجين المشع. احتضان للمدة المطلوبة.
يوفر المخزن المؤقت الدافئ مسبقا درجة حرارة فسيولوجية ودرجة حموضة مناسبة مطلوبة لامتصاص الجلوتامين الخلوي. تتكون ناقلات الجلوتامين من مجالات النقل - المسؤولة عن نقل الركيزة عبر النقل المشترك المقترن بأيون الصوديوم - ومجالات السقالات المثبتة على الغشاء.
يرتبط مجال النقل بالجلوتامين المليء بالإشعاع جنبا إلى جنب مع أيونات الصوديوم من المخزن المؤقت. عند الارتباط ، يطلق الجزيئات في السيتوبلازم. في الوقت نفسه ، ينقل مجال النقل أيونات الصوديوم داخل الخلايا والأحماض الأمينية المحايدة خارج الخلية ، مما يؤدي إلى التوازن الخلوي.
اغسل الخلايا بمحلول بارد مثلج ، وقم بإنهاء التفاعل وإزالة أي جلوتامين خارج الخلية. أضف محلول منظف. يعمل المنظف على تحلل الخلايا ، مما يتسبب في إطلاق الجلوتامين المسمى بالإشعاع داخل الخلايا.
الطرد المركزي المحلل. أضف المادة الطافية المحتوية على الجلوتامين إلى قارورة مع كوكتيل متلألئ ، وضع القارورة داخل عداد التلألؤ.
تنبعث جزيئات الجلوتامين ذات العلامات المشعة من جزيئات بيتا عالية الطاقة. تمتص الوميضات الموجودة في الكوكتيل الجسيمات وتنبعث منها نبضات ضوئية يتم اكتشافها بواسطة عداد التلألؤ.
قم بقياس النشاط الإشعاعي لتقدير امتصاص الجلوتامين الخلوي.
لبدء فحص امتصاص الأحماض الأمينية ، لوحة 5 × 104 خلايا ST2 ، في كل بئر من صفيحة زراعة الأنسجة المكونة من 12 بئر في وسط ألفا MEM مكمل ب FBS والبنسلين والستربتومايسين. قم بتركيب آبار إضافية من الخلايا لتحديد عدد الخلية لكل شرط للتطبيع.
بعد ذلك ، قم باحتضان الخلايا في حاضنة زراعة الخلايا المرطبة عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة يومين إلى ثلاثة أيام حتى تلتقي. بعد الحضانة ، استنشق الوسط ، واغسل الخلايا مرتين بمليلتر واحد من PBS عند درجة الحموضة 7.4. بعد ذلك ، قم بشفط PBS قبل غسل الخلايا مرة واحدة ، باستخدام مليلتر واحد من Krebs Ringers HEPES ، أو KRH.
احتضان الخلايا مع 0.5 مل من KRH المحضرة حديثا والتي تحتوي على أربعة ميكروكوري لكل مليلتر L- [3،4-3H] - وسائط عمل الجلوتامين لمدة خمس دقائق. بعد الحضانة ، اجمع الوسط المشع لتوزيعه في حاوية النفايات السائلة. ثم اغسل الخلايا ثلاث مرات باستخدام KRH المثلج لإنهاء التفاعل.
بعد ذلك ، أضف ملليلترا واحدا من كبريتات دوديسيل الصوديوم 1٪ إلى كل بئر ، وقم بترتيتر الخليط 10 مرات لتحلل الخلايا وتجانسها. بعد ذلك ، قم بنقل المحللة الخلوية إلى أنبوب سعة 1.5 ملليلتر ، وقم بتوضيح المحللة عن طريق الطرد المركزي بسرعة لا تقل عن 10,000 جم لمدة 10 دقائق.
انقل المادة الطافية إلى قارورة تلألؤ تحتوي على ثمانية ملليلتر من محلول التلألؤ ، واقرأ النشاط الإشعاعي بالعدد في الدقيقة باستخدام عداد التلألؤ.
من الصفائح غير المشعة المتبقية للخلايا ، قم بعمل التربسين وإعادة تعليق الخلايا وعدها لتقدير عدد الخلايا في الثقافات المشعة المحللة. باستخدام مقياس كثافة الدم ، احسب عدد الخلايا لكل بئر غير مشع لكل حالة تجريبية.