مقايسة البيروفات لتقدير مستويات البيروفات في الكسور الخلوية للديدان

يمكن تقدير المستويات الخلوية للبيروفات - وهو وسيط رئيسي في المسارات الكيميائية الحيوية المنتجة للطاقة - باستخدام المقايسات اللونية القائمة على الإنزيم.

لتحديد مستويات البيروفات في خلايا Caenorhabditis elegans - وهي ديدان خيطية غير طفيلية - خذ جزءا خلويا محضرا من الديدان البالغة التي تحتوي على البيروفات. عالج المحلول ، وإزالة البروتينات الخلوية ، واجمع الجزء الخلوي المصفى - عينة الاختبار - الذي يحتوي على البيروفات. يضمن عدم وجود البروتينات الخلوية تحديدا دقيقا لمستويات البيروفات.

ابدأ بإضافة كاشف عامل يحتوي على إنزيمات بيروفات أوكسيديز وبيروكسيداز الفجل الحار ، وصبغة كروموجينيك. احتضان الخليط في الظلام لمدة كافية.

أثناء الحضانة ، يتفاعل بيروفات أوكسيديز مع البيروفات - ركيزته - مما يولد بيروكسيد الهيدروجين كمنتج ثانوي. يمنع غياب الضوء التحلل التلقائي لبيروكسيد الهيدروجين.

يحفز بيروكسيداز الفجل التفاعل بين بيروكسيد الهيدروجين والصبغة الكروموجينيكية ، مما ينتج عنه منتج ملون. تتناسب شدة منتج التفاعل الملون طرديا مع تركيز البيروفات في العينة.

عند الانتهاء من فترة الحضانة ، ضع العينة داخل قارئ الألواح وقم بقياس الامتصاص. قم بإنشاء منحنى قياسي باستخدام تخفيف تسلسلي بتركيزات بيروفات معروفة.

ارسم قيمة الامتصاص المقاسة لعينة الاختبار على المنحنى لتحديد تركيز البيروفات في عينة الاختبار.

استخدم مجموعة الفحص اللوني لقياس تركيز البيروفات في عينات الاختبار ، وإجراء فحوصات مزدوجة.

أضف 10 ميكرولترات من عينات الاختبار إلى آبار مختلفة من صفيحة 96 بئرا ، وأضف 90 ميكرولترا من كاشف العمل إلى كل عينة. احتضن مغطى لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. بعد ذلك ، ضع اللوحة في قارئ صفيحة دقيقة لقياس امتصاص كل بئر عند 570 نانومتر.

ارسم منحنى البيروفات القياسي واحسب تركيزات البيروفات من المنحنى القياسي بضرب كل تركيز في 2.25.