الفحص الطيفي لتحديد نشاط سينسيز الجليكوجين

سينسيز الجليكوجين - إنزيم حاسم في تخليق الجليكوجين - يشق جلوكوز ثنائي فوسفات اليوريدين ، أو UDP-glucose - سكر النيوكليوتيدات - في UDP وبقايا الجليكوسيل ويضيف مونومر الجلوكوز المنبعث إلى سلسلة الجليكوجين المتنامية.

لتقدير نشاط سينسيز الجليكوجين ، ابدأ بتناول خليط تفاعل يحتوي على الجليكوجين ، و UDP-glucose ، و ATP ، و phosphoenolpyruvate ، و nicotinamide adenine dinucleotide ، أو NADH ، في أنبوب. أضف ثنائي فوسفات النوكليوزيد ، أو NDP ، وإنزيم كيناز ، وكوكتيل إنزيم بيروفات كيناز ونازعة هيدروجين اللاكتات. امزج المحتويات واحتضنها.

أضف عينة تحتوي على سينسيز الجليكوجين إلى الأنبوب لبدء التفاعل الأنزيمي.

يعمل سينسيز الجليكوجين على UDP-glucose ، مما يولد UDP وبقايا جليكوزيل. يمتص الإنزيم مونومر الجلوكوز الحر ويدمجه في سلسلة الجليكوجين لخليط التفاعل. في وجود ATP ، يقوم NDP kinase في خليط التفاعل بفسفرة UDP غير المستخدم ، ويحوله إلى UTP ويولد ADP.

يعمل إنزيم البيروفات كيناز على ADP ويضيف فوسفات يتبرع به فوسفوينول بيروفات في خليط التفاعل لإنتاج ATP والبيروفات. بعد ذلك ، يقوم نازعة هيدروجين اللاكتات بتحويل البيروفات إلى لاكتات ويؤكسد NADH أثناء التفاعل.

قم بقياس الانخفاض في امتصاص NADH عند 340 نانومتر لتحديد كمية NADH المستهلكة ، مما يشير إلى نشاط الإنزيم الناجح.

للبدء بتحديد نشاط سينسيز الجليكوجين ، قم بإذابة محاليل المخزون المعدة مسبقا من UDP-glucose و ATP و phosphoenolpyruvate و NDP kinase على الجليد. سخني حمام مائي إلى 30 درجة مئوية.

عندما تكون محاليل المخزون جاهزة ، قم بإعداد خليط فحص كاف وفقا لعدد فحوصات سينسيز الجليكوجين ، عن طريق إضافة الكواشف إلى أنبوب سعة 15 مليلتر ، كما هو موضح في بروتوكول النص.

قم بإعداد تفاعل فارغ عن طريق استبدال NADH من خليط التفاعل بالماء ، ونقل التفاعل إلى كوفيت ميثاكريليت يمكن التخلص منه. استخدم التفاعل الفارغ لضبط "صفر" على مقياس الطيف الضوئي عند الطول الموجي 340 نانومتر.

خذ 770 ميكرولتر من خليط التفاعل في أنبوب سعة 1.5 ملليلتر ، وأضف بالتتابع 2 ميكرولتر لكل منهما ، من خليط NDP كيناز وبيروفات كيناز / نازعة هيدروجين اللاكتات إلى الأنبوب.

بعد الخلط برفق ، احتضن الأنبوب عند 30 درجة مئوية في الحمام المائي ، لمدة 3 دقائق لتسخين خليط التفاعل. بعد ذلك ، أضف 30 ميكرولترا من العينة التي تحتوي على سينسيز الجليكوجين ، في مخزن مؤقت 20 ملليمولار تريس عند درجة الحموضة 7.8 ، واخلطه برفق قبل نقل خليط التفاعل إلى كوفيت ميثاكريليت يمكن التخلص منه.

ضع الكوفيت في مقياس الطيف الضوئي ، وسجل الامتصاص عند 340 نانومتر على فترات زمنية محددة لمدة 10 إلى 20 دقيقة. ثم ارسم الامتصاص الذي تم الحصول عليه في الوقت المناسب.