JoVE Encyclopedia of Experiments
التقنيات البيولوجية
0 مشاهدات • 3:52 د • July 8th, 2025
للقياس المستمر لسلوك الخلية باستخدام تحليل الخلية في الوقت الفعلي ، RTCA ، احصل على صفيحة RTCA microtiter تحتوي على مصفوفات أقطاب كهربائية دقيقة ذهبية لقياس مقاومة مدمجة في قاع البئر. أضف بعناية وسط زراعة الخلايا إلى الآبار.
داخل الوسط الموصل للكهرباء ، قم بتطبيق جهد كهربائي ضعيف عبر الأقطاب الكهربائية الدقيقة. يتسبب الجهد في تدفق التيار الكهربائي بين الأقطاب الكهربائية الدقيقة ، مما يسهل قياس مقاومة خط الأساس - المقاومة الكهربائية المتأصلة في الوسط.
ماصة التركيزات المطلوبة من تعليق خلايا الثدييات إلى الآبار المحتوية على المتوسطة. اسمح للخلايا بالتوزيع بشكل موحد في البئر.
أثناء الحضانة ، تلتصق الخلايا بقاع البئر. تعمل الخلايا الملتصقة على الأقطاب الكهربائية الدقيقة كعازل ، مما يحد من تدفق التيار ويزيد من المقاومة.
تدريجيا ، تتكاثر الخلايا على الأقطاب الكهربائية الدقيقة ، مما يؤدي إلى زيادة المعاوقة الأسية.
بعد تكوين طبقة الخلية المتقاربة ، تواجه الخلايا الحرمان من المغذيات وتخضع للموت. نتيجة لذلك ، تنفصل الخلايا عن الأقطاب الكهربائية الدقيقة ، مما يقلل من المقاومة.
يسهلقياس المعاوقة المستمر المراقبة في الوقت الفعلي للأحداث الخلوية ، بما في ذلك تكاثر الخلايا وموتها.
لتحديد كمية الخلية المناسبة لعدوى الخلايا ، قم بإعداد مزارع خلايا MDCK ملتقية على مدار 24 ساعة ، حوالي 80٪ ، كما هو موضح ، قبل غسل الخلايا باستخدام PBS ، وحصادها بحضانة لمدة 45 دقيقة في 3 ملليلتر من 0.25٪ trypsin-EDTA لكل قارورة عند 37 درجة مئوية.
عندما تنفصل الخلايا ، أوقف التفاعل ب 7 ملليلتر من وسط المزرعة الطازجة لكل قارورة ، واحسب الخلايا من كل ثقافة. قم بتخفيف الخلايا إلى 4 × 105 خلايا لكل مليلتر من وسط زراعة الخلايا ، وقم بإجراء تخفيفات تسلسلية مزدوجة للخلايا ، كما هو موضح.
ضع لوحة E في درجة حرارة الغرفة لعدة دقائق ، قبل إضافة 100 ميكرولتر من وسط زراعة الخلايا إلى كل بئر دون لمس أقطاب اللوحة الإلكترونية. افتح الحوامل وأدخل الواجهة الأمامية للوحة في جيب المهد لأداة قياس المعاوقة. أغلق باب الحاضنة وافتح البرنامج.
في "الإعداد الافتراضي لنمط التجربة"، قم بتمييز الحوامل المحددة وانقر نقرا مزدوجا على الصفحة العلوية لإدخال اسم التجربة. انقر فوق "تخطيط" وأدخل معلومات العينة اللازمة لكل بئر محدد من اللوحة. انقر فوق "جدولة" | "الخطوات" |، و "إضافة خطوة". سيضيف البرنامج تلقائيا خطوة مدتها 1 ثانية لقياس مقاومة الخلفية.
انقر فوق "تنفيذ" و "بدء / متابعة". انقر فوق "مؤامرة" و "إضافة" لتحديد الآبار المناسبة ، مع التأكد من أن مقاومة الخلفية بين سالب 0.1 و 0.1 ، قبل الانتقال إلى الخطوة التالية.
بعد ذلك ، قم بإزالة اللوحة من المهد وأضف 100 ميكرولتر من كل معلق خلية إلى الآبار المناسبة في نسختين. اترك اللوحة الإلكترونية في غطاء التدفق الصفحي لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة للسماح بتوزيع موحد للخلايا على قيعان الآبار ، قبل تحميل اللوحة الإلكترونية في جيب المهد. انقر فوق "جدولة" و "إضافة خطوة" ، وأدخل قيما لمراقبة الخلايا كل 30 دقيقة لمدة 200 تكرار قبل تحديد "بدء / متابعة".
للتحقق من بيانات مقاومة الخلية ورسمها ، انقر فوق "مخطط" وحدد تركيز الخلايا الذي يسبق المرحلة الثابتة مباشرة بعد 24 ساعة من البذر ، للحصول على الخلايا التي لا تزال في مرحلة النمو أثناء العدوى الفيروسية.
تصف هذه المقالة طريقة للقياس المستمر لسلوك الخلايا باستخدام تحليل الخلايا في الوقت الفعلي (RTCA). وتتضمن هذه التقنية مراقبة التغيرات في الممانعة في المزارع الخلوية لتقييم تكاثر الخلايا وموتها.
تتيح المراقبة الآنية للمقاومة الكهربائية تقييماً مستمراً وخالياً من الوسوم للديناميكيات الخلوية، مما يوفر رؤى تنبؤية حول التكاثر والسمية الخلوية للتحقق من الأهداف في المراحل المبكرة. ويدعم هذا النهج تقليل المخاطر الميكانيكية من خلال تقديم بيانات كمية وقابلة للتكرار تساهم في اتخاذ قرارات الاستمرار أو التوقف في عمليات تحديد المركبات الرائدة وسير العمل في الدراسات قبل السريرية. كما تعزز هذه الطريقة من صلة المحفظة البحثية من خلال تقليل الغموض البيولوجي في الأنظمة ذات الصلة بالمرض قبل الانتقال إلى التطبيقات اللاحقة التي تتطلب موارد كثيفة.
يتناسب الرصد الآني للمقاومة الكهربائية ضمن سلسلة الاكتشاف، بدءاً من التحقق المبكر من الهدف وصولاً إلى تحديد المركبات الرائدة ثم التقييم قبل السريري، مما يوفر دقة حركية للأحداث الخلوية تدعم اتخاذ القرارات القائمة على البيانات في كل مرحلة.
فيديوهات ذات صلة
0 مرات المشاهدة
فيديوهات ذات صلة
0 مرات المشاهدة
فيديوهات ذات صلة
0 مرات المشاهدة
فيديوهات ذات صلة
0 مرات المشاهدة
فيديوهات ذات صلة
0 مرات المشاهدة
فيديوهات ذات صلة
0 مرات المشاهدة
فيديوهات ذات صلة
0 مرات المشاهدة
فيديوهات ذات صلة
0 مرات المشاهدة
فيديوهات ذات صلة
0 مرات المشاهدة
فيديوهات ذات صلة
0 مرات المشاهدة
آخر تحديث: 29 أغسطس 2026