JoVE Encyclopedia of Experiments
التقنيات البيولوجية
0 مشاهدات • 3:00 د • July 8th, 2025
أثناء الإصابة بفيروس الأنفلونزا ، يدخل الفيروس إلى الخلية من خلال الالتقام الخلوي ويختطف آلية الخلية المضيفة ، مما ينتج عنه فيروسات ذرية. يتم إطلاق هذه الخلايا ، وتصيب الخلايا المجاورة ، مما يتسبب في سلسلة من العدوى.
لقياس نسبة فيروس الأنفلونزا المعدية إلى الخلايا في المزرعة - تعدد العدوى - أضف كثافة مناسبة من معلق خلايا الثدييات التي تم الحصول عليها حديثا في صفيحة ميكروتيتر.
تحتوي اللوحة على أقطاب كهربائية ذهبية دقيقة لقياس المعاوقة مدمجة في قاع البئر. احتضان ، مما يسمح للخلايا بالالتصاق بقاع البئر والوصول إلى مرحلة النمو الأسي قبل الإصابة.
استخدم إمكانات كهربائية صغيرة بين الأقطاب الكهربائية الدقيقة. تعمل الخلايا الملتصقة بالأقطاب الكهربائية الدقيقة كعوازل ، مما يحد من تدفق التيار ويزيد من المقاومة الكهربائية - المعاوقة - التي يتم قياسها.
قم بإزالة الوسائط. ماصة تعليق فيروس الأنفلونزا في الآبار. مكمل مع إندوبروتياز سيرين مناسب.
أثناء الحضانة ، يشق البروتينات الداخلية سيرين وينشط هيماجلوتينين البروتين السكري الفيروسي ، مما يسهل ارتباطه بمستقبلات معينة للخلايا المضيفة ودخول الخلايا الفيروسية اللاحقة.
باستخدام آلية الخلية المضيفة ، يتم إنتاج جزيئات فيروسية جديدة وإطلاقها ، مما يصيب الخلايا المجاورة. نتيجة لذلك ، تخضع الخلايا المصابة بالفيروس لتغيرات مورفولوجية وتظهر تأثيرات اعتلال خلوي ، مما يؤدي إلى موت الخلايا - تنفصل الخلايا عن سطح القطب الصغير ، مما يقلل من المعاوقة بمرور الوقت.
حدد الوقت المستغرق لتقليل المعاوقة إلى نصف المعاوقة الأولية قبل إضافة الفيروس. يشير الإطار الزمني الأقصر إلى زيادة تعدد العدوى الفيروسية.
لتحديد العلاقة بين قيم CIT50 وتعدد العدوى ، بعد زراعة 3 × 104 خلايا MDCK مقسمة حديثا في كل جدار من لوحة الميكروتيتر الإلكترونية لمدة 24 ساعة ، اغسل الخلايا مرتين ب 100 ميكرولتر من وسط انتشار الفيروس الطازج لكل بئر لكل غسلة ، واستخدم ماصة أحادية القناة لإضافة 100 ميكرولتر من المعلق الفيروسي إلى كل بئر.
عند إضافة جميع تخفيفات الفيروس ، قم بتحميل اللوحة برفق في جيب المهد للأداة عند 35 درجة مئوية ، وابدأ في مراقبة مقاومة الخلية كل 15 دقيقة لمدة 100 ساعة على الأقل ، كما هو موضح.
بعد دورتين من القياسات ، انقر فوق "إيقاف الجهاز مؤقتا" وإزالة اللوحة الإلكترونية من الحامل. أضف 100 ميكرولتر من وسط انتشار الفيروس المكمل ب TPCK-trypsin إلى كل بئر ، وأعد لوحة اللوحة الإلكترونية إلى جيب المهد. ثم ابدأ التحليل.