فحص المواد التفاعلية لحمض ثيوباربيتوريك لتقييم الإجهاد التأكسدي في مصل الدم البشري

تولد الخلايا مستويات منخفضة من الجذور الحرة أثناء عمليات التمثيل الغذائي.

في الحالات المرضية ، يحدث الإفراط في إنتاج الجذور الحرة ، مما يسبب الإجهاد التأكسدي. تهاجم هذه الجذور الحرة الأحماض الدهنية المتعددة غير المشبعة في فوسفوليبيدات الغشاء الخلوي في عملية تسمى بيروكسيد الدهون. هذا يشكل منتجات أكسدة سامة ، بما في ذلك هيدروبيروكسيدات الدهون ومالوندي الديهايد (MDA) ، والتي تسبب تلف الغشاء وموت الخلايا.

للكشف عن الإجهاد التأكسدي في مصل الدم البشري في المختبر باستخدام مقايسة المادة التفاعلية لحمض الثيوباربيتوريك (TBARS) ، ابدأ بأنبوب يحتوي على مصل بشري معالج بمركب محفز للأكسدة. يتكون المصل المعالج بشكل رئيسي من منتجات بيروكسيد الدهون - MDA وهيدروبيروكسيدات الدهون - جنبا إلى جنب مع الدهون الفوسفورية والدهون والبروتينات.

بعد ذلك ، أضف كبريتات دوديسيل الصوديوم (SDS) واخلطها لإذابة الدهون وإطلاق MDA. يفسد SDS أي بروتينات ملوثة. أضف عازلة حمضية مناسبة ، متبوعا بحمض ثيوباربيتوريك الحمضي (TBA). احتضان في درجة حرارة عالية.

في ظل الظروف الحمضية ودرجات الحرارة المرتفعة ، تتفاعل جزيئات TBA مع MDA ، وتشكل مركب MDA-TBA أحمر وردي مستقر ، يسمى TBARS. احتضان على الجليد لإيقاف التفاعل وتثبيت المجمعات الموجودة.

الطرد المركزي. اجمع وانقل المادة الطافية المحتوية على MDA-TBA إلى صفيحة متعددة الآبار. باستخدام قارئ صفيحة دقيقة ، قم بقياس امتصاص المجمع.

يشير الامتصاص العالي إلى ارتفاع تركيز TBARS ، مما يشير إلى مستويات أعلى من منتجات بيروكسيد الدهون والإجهاد التأكسدي في المصل.

قم بتسمية الأنابيب الزجاجية للعينات المراد تحليلها ، ثم أضف 100 ميكرولتر من العينة المحضرة إلى كل أنبوب. أضف 200 ميكرولتر من 8.1٪ SDS إلى كل عينة ، وقم بتدوير الأنبوب الزجاجي برفق بحركة دائرية للخلط.

أضف 1.5 ملليلتر من محلول أسيتات الصوديوم 3.5 مولار إلى كل عينة. ثم أضف 1.5 مل من محلول حمض ثيوباربيتوريك المائي 0.8٪. ارفع الحجم النهائي في كل أنبوب إلى 4 ملليلتر عن طريق إضافة 700 ميكرولتر من الماء منزوع الأيونات. قم بتغطية الأنابيب الزجاجية بإحكام ، واحتضانها في كتلة تسخين مضبوطة على 95 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة. قم بتغطية الأنابيب بورق الألمنيوم لمنع التكثيف. ثم قم بإزالة الأنابيب من الكتلة واحتضانها على الجليد لمدة 30 دقيقة.

بعد الحضانة ، قم بالطرد المركزي للعينات والمعايير عند 1,500 × جم لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية. انقل 150 ميكرولترا من المادة الطافية من كل أنبوب إلى بئر في لوح سعة 96 بئرا ، وقم بإزالة أي فقاعات هواء بطرف ماصة.

قم بقياس امتصاص العينات عند 532 نانومتر. بعد ذلك ، اطرح متوسط قراءة الامتصاص للعينات الفارغة من جميع قراءات الامتصاص الأخرى.

قم بإنشاء منحنى قياسي واستخدمه لحساب تركيزات العينة غير المعروفة.