مقايسة تنبت المشيمية لدراسة تكاثر الأوعية الدموية الدقيقة للعين خارج الجسم الحي

في عين الثدييات ، تحتوي المشيمية ، الواقعة بين الصلبة وشبكية العين ، على الضامة حول الأوعية الدموية والمشيمية الشعرية - وهي طبقة من الشعيرات الدموية المبطنة بالخلايا الحمضية التي تزود شبكية العين بالأكسجين والمواد المغذية. تحدث الأوعية الدموية غير الطبيعية التي تنبت من المشيمة الشعرية في العديد من أمراض العيون الوعائية.

لدراسة المشيمة الشعرية غير المنظمة التي تنبت خارج الجسم الحي ، خذ نباتات عين الفأر المحصودة التي تحتوي على المشيمية المرتبطة بالصلبة وظهارة صبغة الشبكية ، أو RPE.

أضف قطرات من مستخلص الغشاء القاعدي ، أو BME - هيدروجيل غني ببروتينات المصفوفة خارج الخلية - إلى آبار الصفيحة متعددة الآبار. ضع النباتات الخارجية في القطرة ، وتجنب تسطيح الأنسجة. اسمح ل BME بالتصلب.

أضف وسيطا مكملا بالخلية البطانية ، أو عوامل النمو الخاصة بالإي الأوروبي. حضن. يفرز RPE عامل نمو البطانية الوعائية ، والذي ، إلى جانب عوامل النمو الخاصة ب EC ، يحفز تكاثر EC الشعري.

يشكل BME المتصلب مصفوفة خارج الخلية تعزز تكاثر ECs لتشكيل أنابيب تشبه الشعيرات الدموية. تهاجر الحضجة وتلتصق بهذه الشعيرات الدموية المنبثقة ، مما يسهل نضوج ECs الشعرية.

تفرز البلاعم المنشطة في منطقة الإنبات إنزيمات لهضم غشاء Bruch - الطبقة المشيمية الأعمق - والتي تمكن البراعم من الهجرة إلى RPE.

تحت المجهر ، تخيل الشعيرات الدموية النابتة. باستخدام برنامج مناسب ، قم بقياس المنطقة التي يغطيها برعم المشيمية.

تشير منطقة الإنبات المشيمية الأكبر إلى أن المشيمة الشعرية التقدمية تنبت في الشطة.

أضف 30 ميكرولترا من BME المذاب في وسط كل بئر من لوحة زراعة الأنسجة المكونة من 24 بئرا. تأكد من أن قطرة BME تشكل قبة محدبة في الجزء السفلي من اللوحة دون لمس الحواف.

ضع الأنسجة في منتصف BME. لا تقم بتسطيح المشيمية. دع الأنسجة تتوسع داخل BME. احتضن الطبق عند 37 درجة مئوية لمدة 10 دقائق للسماح للهلام بالتصلب. ثم أضف 500 ميكرولتر من الوسط الكلاسيكي الكامل في كل بئر. قم بتغيير الوسيط الكلاسيكي كل يومين.

يمكن ملاحظة تنبت المشيمية بعد ثلاثة أيام بالمجهر. افتح صورة تنبت المشيمية بالصورة J وتحقق من "Image | النوع | و 8 بت" بتدرج الرمادي. ثم قم بتحسين التباين عن طريق تحديد "صورة | ضبط | السطوع / التباين" وتعديله.

استخدم وظيفة "العصا السحرية" لتحديد وإزالة الأنسجة المشيمية الموجودة في وسط البراعم. قم بإزالة خلفية الصورة باستخدام أدوات التحديد المجانية.

بعد ذلك ، انتقل إلى "الصورة | ضبط | عتبة " واستخدم وظيفة "العتبة" لتحديد براعم الأوعية الدموية الدقيقة على الخلفية والمحيط. انقر فوق "F2" وسيظهر ملخص. انقر فوق "حفظ" لحفظ صورة للمنطقة المحددة في نفس المجلد مثل الصورة الأصلية للرجوع إليها في المستقبل.

بعد قياس مجموعة من العينات ، انسخ البيانات المسجلة للتحليل.