مقايسة نشاط مستقبلات الإستروجين المراسل لفحص نشاط الاستروجين النباتي

هرمونات الإستروجين هي هرمونات ستيرويد تعمل كجزيئات إشارات الغدد الصماء وترتبط بالمستقبلات النووية - مستقبلات هرمون الاستروجين بيتا ، وتشكل مجمعات مستقبلات هرمون الاستروجين بيتا.

تتضاءل مجمعات مستقبلات الترابط هذه وتشكل متجانسات في سيتوبلازم الخلية. يدخل المتجانس الناتج إلى النواة ، ويرتبط بعنصر استجابة هرمون الاستروجين ، و ERE - تسلسل محدد للحمض النووي داخل محفز الجين المستهدف - ويبدأ النسخ.

لتحديد نشاط الاستروجين للاستروجين النباتي - مستقلبات ثانوية مشتقة من النباتات تحاكي وظيفة هرمون الاستروجين - ابدأ بصيحة متعددة الآبار تحتوي على خلايا مراسل معلقة في وسط مناسب.

تم تصميم خلايا المراسل للإفراط في التعبير عن مستقبلات هرمون الاستروجين بيتا ونقلها بجين لوسيفيراز مدمج في محفز ERE. أضف محلول العينة الذي يحتوي على فيتويستروغنز واحتضن.

أثناء الحضانة ، يرتبط هرمون الاستروجين النباتي بمستقبلات هرمون الاستروجين ، بيتا - معبرا عنها في خلايا المراسل. بمجرد ربطها ، تتضاءل مجمعات مستقبلات الاستروجين النباتي وتنتقل إلى النواة.

داخل النواة ، يرتبط المركب الخافت ب ERE. يبدأ الارتباط في نسخ جين لوسيفيراز ، مما ينتج عنه إنزيم لوسيفيراز. بعد ذلك ، قم بإزالة الوسيط وأضف كاشفا يحتوي على ركيزة لوسيفيراز. احتضان للسماح لإنزيم لوسيفيراز المعبر عنه بأكسدة ركيزته وإنتاج اللمعان.

قياس اللمعان ، مما يؤكد نشاط الاستروجين للمركب في العينة.

دوامة العينات. بعد ذلك ، أضف 4 ميكرولتر من كل عينة إلى 496 ميكرولتر من وسط الفحص المركب ، للحصول على محلول DMSO بنسبة 0.8٪.

قم بتطهير السطح الخارجي لأنبوب وسط استعادة الخلايا الدافئ مسبقا باستخدام 70٪ من الإيثانول ، وانقل 10 مل من الوسط إلى أنبوب من خلايا المراسل المجمدة لإذابتها. أغلق أنبوب خلايا المراسل ، وضعه في حمام مائي بدرجة حرارة 37 درجة مئوية لمدة 5 إلى 10 دقائق.

بعد استرداد الخلايا من الحمام المائي ، قم بقلب الأنبوب برفق عدة مرات لتفتيت مجاميع الخلايا ، وإنتاج تعليق متجانس. ثم قم بتنظيف سطح الأنبوب بنسبة 70٪ من الإيثانول.

استخدم ماصة متعددة القنوات لتوزيع 100 ميكرولتر من تعليق الخلية المراسلة في كل بئر من لوحة 96 بئرا. بعد ذلك ، قم بتوزيع 100 ميكرولتر من العينات في ثلاث نسخ في الآبار المناسبة. احتضان اللوحة عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة 22 إلى 24 ساعة.

قبل نهاية حضانة اللوحة مباشرة ، قم بإزالة ركيزة الكشف والمخزن المؤقت للكشف من الثلاجة ، وضعهما في منطقة منخفضة الإضاءة حتى يوازنها مع درجة حرارة الغرفة. ثم اقلب كل أنبوب برفق لخلط المحاليل.

مباشرة قبل اكتمال حضانة اللوحة ، اسكب محتويات مخزن الكشف بالكامل في أنبوب ركيزة الكشف ، لإنشاء كاشف للكشف عن اللوسيفيراز. امزج الأنبوب برفق حتى لا ينتج رغوة.

تخلص من محتويات لوحة العينة في حاوية نفايات مناسبة ، واضغط عليها برفق على منشفة ورقية ماصة نظيفة لإزالة القطرات الأخيرة من الآبار. أضف 100 ميكرولتر من كاشف الكشف عن لوسيفيراز إلى كل بئر ، واترك لوحة الفحص ترتاح في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة. بعد ذلك ، قم بتحديد كمية اللمعان باستخدام مقياس إضاءة لقراءة 96 لوحة.