نقل طاقة رنين فورستر الذي تم حله بمرور الوقت لمراقبة فسفرة البروتين في الخلايا

تعد فسفرة بعض البروتينات الخلوية آلية تنظيمية رئيسية تؤدي إلى تنشيطها أو تعطيلها.

لمراقبة فسفرة بروتين معينة ، خذ صفيحة مزرعة تحتوي على خلايا ملتصقة. عالج الخلايا بمحفز لتعزيز فسفرة البروتينات في الخلايا. استنشق الوسط المستهلك ، وأضف مخزلا مؤقتا لتحلل الخلايا وكوكتيل مثبط الفوسفاتيز.

تتسبب المكونات العازلة في تحلل الخلايا ، وتطلق المحتويات الخلوية جنبا إلى جنب مع البروتينات الفسفرة وغير الفسفرة. يعمل كوكتيل المثبط على تعطيل الفوسفاتيز الخلوي ، لذلك تظل البروتينات الفسفرية سليمة.

انقل محللة الخلية إلى لوحة كشف منخفضة الحجم. عالج المحللة بالأجسام المضادة المانحة والمقبلة المرتبطة بالفلوروفورات المختلفة الحساسة للضوء.

أثناء الحضانة ، تتعرف الأجسام المضادة المانحة على حاتمة معينة على بروتين الاختبار ، مما يسمح لها بربط المتغيرات الفسفرة وغير الفسفرية للبروتين. في المقابل ، ترتبط الأجسام المضادة المستقبلة حصريا بالشكل الفسفوري لبروتين الاختبار.

هذا الربط يجعل الفلوروفور المتقبل بالقرب من الفلوروفور المانح في متغيرات البروتين الفسفرة. يؤدي هذا القرب إلى نقل طاقة رنين Förster ، أو FRET - ظاهرة نقل الطاقة المعتمدة على المسافة بين اثنين من الفلوروفورات الحساسة للضوء.

اقرأ اللوحة على قارئ الألواح الدقيقة المتوافق مع FRET.

عند الإضاءة ، تتحمس الفلوروفورات المانحة ؛ يؤدي ذلك إلى نقل الطاقة إلى