الفحص القائم على اللمعان لتقييم السمية العصبية لمركبات الاختبار على الخلايا العصبية

يعد نمو العصبيات - حيث تطور الخلايا العصبية الإسقاطات - أمرا بالغ الأهمية للوظيفة العصبية والتجديد.

لتقييم التأثيرات السمية العصبية لمركبات الاختبار المعززة لنمو الخلايا العصبية في المختبر ، احصل على خلية سلف عصبية بشرية ، hNPC ، تعليق في وسائط التمايز.

قم بزرع الخلايا في آبار صفائح متعددة الآبار مغطاة ببولي إل ليسين ولامينين ، مما يسهل ارتباط الخلية بقاع البئر ويدعم النمو الخلوي. تعزز مكونات وسائط التمايز تمايز hNPC إلى خلايا عصبية.

عالج مجموعة واحدة من الآبار بمركب اختبار تعزيز نمو العصب. يتفاعل هذا مع الخلايا العصبية المشتقة من hNPC وقد يحفز نمو العصبية, دون تعطيل عمليات التمثيل الغذائي الخلوية والتركيز اللاحق من أدينوسين ثلاثي الفوسفات, ATP — مصدر الطاقة الخلوية الأساسي.

أضف الكاشف أحادي الخطوة الذي يحتوي على المنظفات وإنزيم لوسيفيراز وركيزة لوسيفيراز ومثبطات اللوسيفيرين و ATPase جنبا إلى جنب مع أيونات المغنيسيوم واخلطها.

تعطل المنظفات الغشاء الخلوي ، مما يؤدي إلى تحلل الخلايا وإطلاق ATP داخل الخلايا في المحلول. تمنع مثبطات ATPase ATPase الذاتية المنبعثة ، والتي قد تتداخل مع قياس ATP. أجهزة الطرد المركزي ، ترسيب حطام الخلية.

أثناء الحضانة ، يتسبب ATP الذي تم إطلاقه مع أيونات المغنيسيوم في ارتباط لوسيفيرين باللوسيفيراز ، مما يؤدي إلى أكسدة لوسيفيرين في أوكسيلوسيفيرين شديد الإثارة ، مما يؤدي إلى انبعاث فوتون مضيء حيوي عند الاسترخاء في حالته الأرضية. باستخدام قارئ صفيحة دقيقة ، قم بقياس اللمعان ، مما يدل على تركيز ATP.

يمثل تركيز ATP العالي قابلية أعلى للخلية للحياة ، مما يشير إلى عدم وجود سمية كبيرة لمركب الاختبار على الخلايا العصبية.

لطلاء اللوحة ، أضف 30 ميكرولترا من بولي إل ليسين في كل بئر من صفيحة 384 بئر ، واحتضن اللوحة في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة واحدة. اغسلها مرتين باستخدام PBS ، واتركها تجف لمدة 30 دقيقة تقريبا.

أضف 30 ميكرولترا من اللامينين إلى كل بئر ، ثم احتضن الطبق عند 37 درجة مئوية لمدة ساعتين. كرر الغسيل باستخدام PBS ، واستمر في طلاء الخلايا. أضف 20,000 من المجالات العصبية أحادية الخلية في 25 ميكرولترا من وسائط التمايز ، إلى كل بئر من اللوحة المكونة من 384 بئرا ، واحتضن اللوحة عند 37 درجة مئوية لمدة 5 أيام.

مطلوب مهارات سحب عينات عالية الدقة لطلاء العدد الدقيق للمجالات العصبية المصنفة إلى خلايا مفردة. لذلك ، يوصى بتفريق المجالات العصبية إلى خلايا عصبية ، قبل الطلاء لتحقيق نتائج أكثر قابلية للتكرار.

بعد الحضانة ، أضف 5 ميكرولتر من مركب الاختبار إلى كل بئر بمعدل 6 أضعاف التركيز المطلوب ، واحتضن الخلايا لمدة 24 ساعة أخرى.

لإجراء فحص صلاحية الخلية ، أضف 30 ميكرولترا من الكاشف المضيء إلى كل بئر ، واترك اللوحة على شاكر لمدة دقيقتين. الطرد المركزي للوحة عند 300 إلى 400 مرة غرام لمدة 30 ثانية. ثم احتضن اللوحة في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق ، وحمايتها من الضوء. بعد الحضانة ، قم بقياس اللمعان على قارئ صفيحة دقيقة.