مقايسة تكميل لوسيفيراز سبليت لتحديد تفاعلات محددة بين البروتين والبروتين

0 views • 4:02 min • July 8th, 2025

Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تعتبر تفاعلات البروتين والبروتين ضرورية للوظائف الخلوية الحيوية.

لدراسة التفاعلات بين بروتينات الغشاء - بروتينات الغشاء التي تمتد على طبقة ثنائية الدهون من غشاء الخلية ، ابدأ بآبار صفيحة متعددة الآبار تحتوي على ثقافة خلايا ثدييات ملتصقة.

بعد ذلك ، أضف محلولا يحتوي على عامل تعداء مناسب وزوج من بلازميدات التعبير.

يقوم أحد تعبير البلازميدات بتشفير بروتين عبر الغشاء ذي الأهمية مدمجا في الجزء الصغير غير الوظيفي من إنزيم لوسيفيراز ؛ يقوم البلازميد الآخر بتشفير بروتين غشائي ثان ذي أهمية مدمج في الجزء الكبير غير الوظيفي من إنزيم لوسيفيراز.

احتضان اللوحة. يسهل عامل التعدي الامتصاص الخلوي لبلازميدات التعبير.

تعبر الخلايا المنقولة بنجاح عن البروتينات عبر الغشاء. يؤدي التفاعل بين بروتينات الغشاء المعبر عنها إلى جلب الأجزاء الصغيرة والكبيرة التي تواجه السيتوبلازم على مقربة ، مما يجعلها ترتبط وتشكل إنزيم لوسيفيراز النشط.

استبدل الوسائط الموجودة في الآبار بوسائط خالية من المصل لتقليل تلألؤ الخلفية. أضف فوريمازين — محلول لوسيفيراز منفذ للخلية. يدخل فوريمازين إلى الخلايا ، وبعد ذلك يؤكسد لوسيفيراز الفوريمازين ، مما ينتج عنه تلألؤ عالي الكثافة.

باستخدام قارئ صفيحة دقيقة ، قم بقياس اللمعان ، مما يشير إلى التفاعل القوي بين بروتينات الغشاء.

احصد الملتصقة HEK293T زراعة الخلايا عن طريق التربسين ، وأعد تعليق الخلايا في وسط نمو كامل مخصص. ضع الخلايا على قاع شفاف ، جانب أبيض ، 96 بئر. اضبط العدد الإجمالي للآبار لاستيعاب جميع المجموعات وعناصر التحكم المختبرة ، بما في ذلك التكرارات. ثم قم بزراعة الخلايا طوال الليل في ظروف قياسية.

في اليوم التالي ، قم بنقل الخلايا بالتركيبات المرغوبة من البلازميدات التعبيرية. قم بتخفيف البلازميدات في وسط خال من المصل إلى 6.25 نانوجرام لكل ميكرولتر لكل بنية ، وأضف كاشف التعداء القائم على الدهون بنسبة الدهون إلى الحمض النووي المناسبة.

احتضان البلازميدات وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. ثم أضف 8 ميكرولترات من خليط الدهون والحمض النووي إلى الآبار المخصصة. امزج محتوى اللوحة بدوران لطيف ، وقم بزراعة الخلايا لمدة 20 إلى 24 ساعة في الظروف القياسية.

في اليوم التالي ، استبدل الوسط المكيف في كل بئر ب 100 ميكرولتر من وسط خال من المصل ، مع التأكد من عدم انفصال الخلايا عند التبادل المتوسط.

قبل قياس التلألؤ مباشرة ، امزج حجما واحدا من furimazine مع 19 حجما من مخزن التخفيف. أضف 25 ميكرولترا من محلول عمل furimazine في كل بئر ، واخلط الطبق برفق باليد ، أو باستخدام شاكر مداري.

أدخل اللوحة في قارئ اللفائح الدقيقة ، وقم بموازنة اللوحة عند 37 درجة مئوية لمدة 10 إلى 15 دقيقة. حدد الآبار المراد تحليلها ، واقرأ التلألؤ بزمن تكامل يبلغ 0.3 ثانية. استمر في مراقبة اللمعان لمدة تصل إلى ساعتين عند الحاجة.

10:20

طريقة لتحديد الصغيرة جزيء مثبطات التفاعل البروتين البروتين بين HCN1 وTRIP8b

Related Videos

0 Views

05:51

بناء من CRISPR Plasmids والكشف عن كفاءة خروج المغلوب في خلايا الثدييات من خلال نظام مراسل Luciferase مزدوجة

Related Videos

0 Views

07:31

غشاء الخلية الأصلية نظام الجسيمات النانوية لتحليل التفاعل البروتينية الغشاء

Related Videos

0 Views

04:29

تنقية تقارب التكميل ثنائي الجزيئات لعزل بروتينين متفاعلين

Related Videos

0 Views

10:13

A تعدد في منصة الفرز القائم على luciferase المراسل لاستجواب المرتبطة بالسرطان نقل الإشارة في الخلايا المستزرعة

Related Videos

0 Views

11:46

التحقيق البروتين البروتين التفاعلات في الخلايا الحية باستخدام الرنين ضوء بارد نقل الطاقة

Related Videos

0 Views

12:53

تحديد الشركاء التفاعل البروتين في خلايا الثدييات عن طريق SILAC مناعي الكمي البروتيوميات

Related Videos

0 Views

08:38

الجينوم على نطاق فحص التفاعلات بين البروتينات التي كتبها البروتين جزء التكملة الفحص (PCA) في الخلايا الحية

Related Videos

0 Views

07:55

لوسيفراس "التكامل بالتصوير الإنزيم" في أوراق نيكوتيانا بينثاميانا "تحديد عابر ديناميات التفاعل" البروتين-بروتين

Related Videos

0 Views

06:45

تشريح مجمعات البروتين متعدد الإشارات بالتكامل Bimolecular انجذاب تطهير (بيكاب)

Related Videos

0 Views

Last updated: 18 July 2026