$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
تعتبر تفاعلات البروتين والبروتين ضرورية للوظائف الخلوية الحيوية.
لدراسة التفاعلات بين بروتينات الغشاء - بروتينات الغشاء التي تمتد على طبقة ثنائية الدهون من غشاء الخلية ، ابدأ بآبار صفيحة متعددة الآبار تحتوي على ثقافة خلايا ثدييات ملتصقة.
بعد ذلك ، أضف محلولا يحتوي على عامل تعداء مناسب وزوج من بلازميدات التعبير.
يقوم أحد تعبير البلازميدات بتشفير بروتين عبر الغشاء ذي الأهمية مدمجا في الجزء الصغير غير الوظيفي من إنزيم لوسيفيراز ؛ يقوم البلازميد الآخر بتشفير بروتين غشائي ثان ذي أهمية مدمج في الجزء الكبير غير الوظيفي من إنزيم لوسيفيراز.
احتضان اللوحة. يسهل عامل التعدي الامتصاص الخلوي لبلازميدات التعبير.
تعبر الخلايا المنقولة بنجاح عن البروتينات عبر الغشاء. يؤدي التفاعل بين بروتينات الغشاء المعبر عنها إلى جلب الأجزاء الصغيرة والكبيرة التي تواجه السيتوبلازم على مقربة ، مما يجعلها ترتبط وتشكل إنزيم لوسيفيراز النشط.
استبدل الوسائط الموجودة في الآبار بوسائط خالية من المصل لتقليل تلألؤ الخلفية. أضف فوريمازين — محلول لوسيفيراز منفذ للخلية. يدخل فوريمازين إلى الخلايا ، وبعد ذلك يؤكسد لوسيفيراز الفوريمازين ، مما ينتج عنه تلألؤ عالي الكثافة.
باستخدام قارئ صفيحة دقيقة ، قم بقياس اللمعان ، مما يشير إلى التفاعل القوي بين بروتينات الغشاء.
احصد الملتصقة HEK293T زراعة الخلايا عن طريق التربسين ، وأعد تعليق الخلايا في وسط نمو كامل مخصص. ضع الخلايا على قاع شفاف ، جانب أبيض ، 96 بئر. اضبط العدد الإجمالي للآبار لاستيعاب جميع المجموعات وعناصر التحكم المختبرة ، بما في ذلك التكرارات. ثم قم بزراعة الخلايا طوال الليل في ظروف قياسية.
في اليوم التالي ، قم بنقل الخلايا بالتركيبات المرغوبة من البلازميدات التعبيرية. قم بتخفيف البلازميدات في وسط خال من المصل إلى 6.25 نانوجرام لكل ميكرولتر لكل بنية ، وأضف كاشف التعداء القائم على الدهون بنسبة الدهون إلى الحمض النووي المناسبة.
احتضان البلازميدات وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. ثم أضف 8 ميكرولترات من خليط الدهون والحمض النووي إلى الآبار المخصصة. امزج محتوى اللوحة بدوران لطيف ، وقم بزراعة الخلايا لمدة 20 إلى 24 ساعة في الظروف القياسية.
في اليوم التالي ، استبدل الوسط المكيف في كل بئر ب 100 ميكرولتر من وسط خال من المصل ، مع التأكد من عدم انفصال الخلايا عند التبادل المتوسط.
قبل قياس التلألؤ مباشرة ، امزج حجما واحدا من furimazine مع 19 حجما من مخزن التخفيف. أضف 25 ميكرولترا من محلول عمل furimazine في كل بئر ، واخلط الطبق برفق باليد ، أو باستخدام شاكر مداري.
أدخل اللوحة في قارئ اللفائح الدقيقة ، وقم بموازنة اللوحة عند 37 درجة مئوية لمدة 10 إلى 15 دقيقة. حدد الآبار المراد تحليلها ، واقرأ التلألؤ بزمن تكامل يبلغ 0.3 ثانية. استمر في مراقبة اللمعان لمدة تصل إلى ساعتين عند الحاجة.