مقايسة التلألؤ الكهربائي الكيميائي لقياس مستويات البروتين المستهدفة في محللة الدماغ

للكشف الكمي عن بروتين معين في تحلل دماغ الفأر باستخدام التلألؤ الكيميائي الكهربائي ، يبدأ ECL ، المقايسة المناعية ، بلوحة فحص متعددة الآبار.

تشتمل الآبار على أقطاب كهربائية عاملة ومضادة ، وتكمل الدائرة الكهربائية. تفصل طبقة عازلة عن الأقطاب الكهربائية ، مما يحسن حساسية الفحص.

أضف الأجسام المضادة أحادية النسيلة الأولية للفأر ضد البروتين المستهدف إلى الآبار. تسهل الأقطاب الكهربائية العاملة ، ذات القدرة الأكبر على الربط ، الأجسام المضادة لتثبيت الجثث عليها.

احتضان بمحلول يحتوي على البروتين ، ويرتبط بأسطح الربط المتبقية للبئر ، مما يقلل من تداخل الخلفية.

أضف محللة الكسر النووي لدماغ الفأر. يرتبط البروتين المستهدف في المحللة على وجه التحديد بالأجسام المضادة وحيدة النسيلة.

أضف الأجسام المضادة متعددة النسيلة غير المسماة ، والتعرف على الحلقات الموجودة على البروتين والارتباط بها ، والتي ترتبط بالأجسام المضادة أحادية النسيلة الأولية على القطب. أضف أجساما مضادة ثانوية محددة تحمل علامة مركب الروثينيوم ، وترتبط بالأجسام المضادة غير المسماة. أضف عازلة مناسبة تحتوي على مادة خافضة للتوتر السطحي - توفر بيئة مناسبة لتوليد ECL - وثلاثي بروبأمين ، TPA.

ضع اللوحة متعددة الآبار في نظام الكشف عن ECL. عند تطبيق الجهد عبر الأقطاب الكهربائية ، يتأكسد مركب الروثينيوم المرتبط بالأجسام المضادة. في الوقت نفسه ، يتأكسد TPA ويفقد البروتون تلقائيا.

جذر TPA الناتج من مركب الروثينيوم المؤكسد إلى حالته المثارة. عند الاسترخاء إلى حالته الأرضية ، ينبعث مركب الروثينيوم من فوتون اكتشفه الكاشف الضوئي.

شدة الضوء المقاسة تركيز البروتين المحدد للمحللة.

استرجع الطبق المكون من 96 بئرا من الثلاجة ، وقم بإزالة ورق القصدير. قم بإزالة محلول طلاء الأجسام المضادة من الآبار عن طريق نقره في حاوية نفايات. ثم اضغط على الطبق على منشفة ورقية لإزالة أي محلول متبقي.

بعد ذلك ، أضف 125 ميكرولترا من محلول الحجب لكل بئر. ثم أغلق اللوحة مرة أخرى بورق لاصق. ضع اللوحة على شاكر صفيحة دقيقة مدارية ، مثبتة على 800 دورة في الدقيقة ، واحتضنها لمدة 90 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.

قم بإذابة الثلج ، قارورة واحدة من محلول مخزون البروتين MeCP2 أو TAT-MeCP2 ، ومحللات دماغ الفأر ، ومحللات HDF. قم بتخفيف محلول مخزون البروتين في أنابيب نظيفة ، كما هو موضح في الجدول 2 من المخطوطة.

بعد ذلك ، قم بتخفيف عينات المحلل. بالنسبة لتحلل دماغ الفأر ، استخدم 1 إلى 20 ميكروغراما لكل 25 ميكرولتر من محلول التحلل. بالنسبة إلى تحلل HDF ، أضف 0.25 إلى 1 ميكروغرام لكل 25 ميكرولتر من محلول التحلل.

بعد احتضان اللوحة المكونة من 96 بئرا لمدة 90 دقيقة ، قم بإزالة محلول الانسداد من الآبار عن طريق نقره في حاوية النفايات. ثم اضغط على الطبق على منشفة ورقية لإزالة أي محلول متبقي. ثم اغسل الطبق 3 مرات ب 150 ميكرولتر من محلول الغسيل ، عن طريق إضافة محلول الغسيل وإزالته على الفور.

أضف 25 ميكرولترا من المعايير والعينات إلى آبار اللوحة المكونة من 96 بئرا. أغلق اللوحة واحتضنها لمدة أربع ساعات أخرى في درجة حرارة الغرفة ، مع اهتزاز ثابت 800 دورة في الدقيقة.

قم بإذابة الجسم المضاد للكشف غير المسمى ، وهو أرنب متعدد النسيلة مضاد ل MeCP2 ، على الجليد. باستخدام محلول مخفف للفحص ، قم بتخفيف الجسم المضاد بنسبة 1: 6000. عندما تنتهي اللوحة المكونة من 96 بئرا من الحضانة على شاكر ، قم بإزالة المعايير والعينات عن طريق تحريك اللوحة في حاوية نفايات. ثم اضغط على الطبق على منشفة ورقية لإزالة أي محلول متبقي.

اغسل الطبق 3 مرات ب 150 ميكرولتر من محلول الغسيل عن طريق إضافة محلول الغسيل وإزالته على الفور. أضف 25 ميكرولترا من محلول الأجسام المضادة للكشف غير المسمى إلى كل بئر باستخدام ماصة متعددة القنوات. أغلق اللوحة واحتضانها لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة مع اهتزاز مستمر عند 800 دورة في الدقيقة.

احصل على الجسم المضاد الثانوي المحدد من الثلاجة ، وضعه على الثلج. خفف الجسم المضاد الثانوي في محلول مخفف بالفحص واخلطه برفق.

لإزالة الجسم المضاد المجاني غير الملصق للكشف من اللوحة المكونة من 96 بئرا ، قم بنقرها في حاوية النفايات ، ثم اضغط على اللوحة على منشفة ورقية. بعد غسل اللوحة 3 مرات ، كما هو موضح سابقا ، أضف 25 ميكرولترا من الجسم المضاد الثانوي إلى كل بئر باستخدام الماصة متعددة القنوات. أغلق اللوحة واحتضانها لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة مع اهتزاز مستمر عند 800 دورة في الدقيقة.

قم بإزالة الجسم المضاد الثانوي الحر عن طريق نقره في حاوية النفايات ، والنقر على اللوحة على منشفة ورقية ، ثم اغسل اللوحة ثلاث مرات كما هو موضح سابقا.

إلى كل بئر من اللوحة ، أضف 150 ميكرولترا من المخزن المؤقت للقراءة الذهبية القائم على 1X مع الفاعل بالسطح ، والذي يحتوي على ثلاثي بروبيلأمين كمتفاعل مشترك لتوليد الضوء.

لتجنب إنتاج فقاعات الهواء، استخدم تقنيات سحب العينات العكسي. ضع اللوحة المكونة من 96 بئرا على منصة الصفيحة الدقيقة مع نظام الكشف عن التلألؤ الكيميائي الكهربائي.

باستخدام كاميرا CCD المدمجة ، ابدأ على الفور في التقاط البيانات. سجل عدد الإشارات التي تتوافق مع وحدات الضوء النسبية وتتناسب طرديا مع شدة الضوء.