فحص Dot Blot لتحديد الجينوم الفيروسي

لتحديد كمية الحمض النووي الفيروسي باستخدام مقايسة اللطخة النقطية ، ابدأ بتعليق الحمض النووي الفيروسي المعزول. عالج بمحلول قلوي لتغيير طبيعة الحمض النووي مزدوج الشريطة إلى خيوط مفردة للتهجين اللاحق.

قم بتجميع جهاز اللطخة النقطية بغشاء نايلون مبلل مسبقا. قم بتحميل الحمض النووي الفيروسي المشوه ومحاليل الحمض النووي البلازميد القياسية الخطية في الآبار. ضع فراغا مناسبا ، مما يسهل نقل الحمض النووي الفيروسي الفعال سالب الشحنة والارتباط بسطح الغشاء موجب الشحنة من خلال التفاعلات الكهروستاتيكية ، وتشكيل أنماط نقطية.

بعد التشغيل ، اغسل الغشاء بمحلول سترات الصوديوم ، مما يساعد على تحسين حساسية الفحص. بعد التجفيف ، قم بتعريض الغشاء للأشعة فوق البنفسجية ، وربط الحمض النووي الملطخ بالغشاء.

أضف جزءا من الحمض النووي غير متجانس بالحرارة وتعليق مسبار الحمض النووي المشع المسمى بالفوسفور الخاص بالجينوم الفيروسي في مخزن التهجين إلى الغشاء. احتضان وتسهيل التهجين.

تعمل شظايا الحمض النووي كعوامل مانعة ، وترتبط بمناطق الغشاء المتبقية ، مما يقلل من ارتباط المسبار غير المحدد. يهجن المسبار المشع مع التسلسل التكميلي على الحمض النووي الفيروسي أحادي الشريطة.

يغسل بمحلول غسيل لإزالة المجسات غير المهجنة. باستخدام نظام مسح الصور الفوسفورية ، حدد الإشارات المشعة المنبعثة من المجسات المشعة المهجنة إلى الجينوم الفيروسي على الغشاء ، للحصول على إشارات اللطخة النقطية.

من المنحنى القياسي ، يمكن استخدام شدة الإشارة لكل نقطة على الغشاء لحساب كمية الحمض النووي الفيروسي في العينة.

لإجراء فحص اللطخة النقطية ، قم بإعداد معايير الحمض النووي البلازميد عن طريق تخفيف الحمض النووي البلازميد لجينوم ناقل AAV إلى 10 نانوغرام لكل ميكرولتر في الماء أو مخزن Tris-HCl. انقل كمية 25 ميكرولترا من الحمض النووي البلازميد المخفف إلى أنبوب جديد ، وقم بخطها بإنزيم تقييد مناسب في حجم تفاعل 50 ميكرولتر لمدة ساعة واحدة.

أضف 450 ميكرولتر من الماء أو TE إلى الأنبوب الذي يحتوي على معيار الحمض النووي البلازميد المهضوم ، واخلطه جيدا. بعد ذلك ، قم بنقل 70 ميكرولترا من هذا الخليط إلى أنبوب طرد مركزي دقيق جديد سعة 1.5 ملليلتر مع 1,330 ميكرولتر من الماء أو TE لعمل معيار بلازميد مخفف.

لإعداد جهاز اللطخة النقطية ، باستخدام المقص ، قم بقص غشاء النشاف إلى حجم مناسب لعدد العينات والمعايير. انقع الغشاء بالماء لمدة 10 دقائق ، قبل وضعه على جهاز اللطخة النقطية. ثم قم بتغطية الآبار غير المستخدمة. أضف الماء إلى الآبار التي سيتم تحميل العينات عليها. ضع مكنسة كهربائية ، واسحب الماء عبر الآبار ، وتحقق من وجود أخطاء ، ثم أعد شد البراغي. أعد الاختبار إذا لزم الأمر.

ضع 400 ميكرولتر من كل معيار بلازميد مخفف للحمض النووي على كل بئر وقم بتشغيل أربعة ممرات من التخفيفات القياسية. استخدم حصتين منفصلتين من الملخص القياسي ، وقم بتحميل كل منهما في نسختين. ثم ضع 200 ميكرولتر لكل بئر من كل عينة من الحمض النووي الفيروسي. ضع مكنسة كهربائية لطيفة لتجميع محاليل الحمض النووي عبر الآبار. بعد ذلك ، بمجرد إفراغ جميع الآبار ، حرر الفراغ عن طريق ضبط الصمام ثلاثي الاتجاهات.

أضف 400 ميكرولتر من المحلول القلوي 1X إلى كل بئر. ثم انتظر لمدة خمس دقائق قبل إعادة وضع الفراغ لتفريغ الآبار. أعد تطبيق الفراغ وتفكيك جهاز اللطخة النقطية. ثم قم بإزالة الغشاء وشطفه باستخدام 2X SSC.

ضع الغشاء على منشفة ورقية نظيفة ، بحيث يكون الجانب المرتبط بالحمض النووي متجها لأعلى ، لإزالة المخزن المؤقت الزائد. استخدم أداة تشابك مناسبة للأشعة فوق البنفسجية لربط الحمض النووي الملطخ بالغشاء بالأشعة فوق البنفسجية. الغشاء جاهز الآن للتهجين.

ضع الغشاء في زجاجة تهجين مع الجانب المرتبط بالحمض النووي لأعلى. اشطف الغشاء ب 5 إلى 10 ملليلتر من مخزن التهجين الدافئ مسبقا ، وتخلص من المخزن المؤقت. بعد ذلك ، أضف 10 مل من مخزن التهجين الدافئ مسبقا ، وضع الزجاجة في فرن تهجين دوار مضبوطة على 65 درجة مئوية. قم بتدوير الزجاجة لمدة خمس دقائق على الأقل.

أضف الحمض النووي للحيوانات المنوية المشوهة والمسبار المشع بسرعة إلى مخزن التهجين في الزجاجة ، ورجها لمدة 10 ثوان حتى تمتزج. أعد الزجاجة إلى فرن 65 درجة مئوية واحتضنها بالتناوب عند 65 درجة مئوية لمدة أربع ساعات على الأقل.

بمجرد اكتمال التهجين ، أوقف الدوران ، وقم بإزالة زجاجة التهجين ، ثم صب محلول المسبار المشع في أنبوب مخروطي سعة 50 مليلتر مع غطاء مانع للتسرب من السدادة. لغسل الغشاء ، أضف 20 إلى 30 ميكرولترا من مخزن الغسيل الدافئ مسبقا إلى زجاجة التهجين ، وقم بتدويره لمدة خمس دقائق. كرر هذا الغسيل مرتين أخريين.

بعد الغسيل الثالث ، قم بإزالة الغشاء من زجاجة التهجين ، وباستخدام المناشف الورقية ، قم بإزالة المخزن المؤقت الزائد من الغشاء. ثم ضع الغشاء في حامل ورق بلاستيكي شفاف. باستخدام عداد جيجر ، تحقق من الإشارات المشعة على الغشاء.

[التريلينج]

بعد تعريض شاشة التصوير الفوسفوري المحذوفة للغشاء ، امسح الشاشة باستخدام نظام مسح الصور الفوسفورية ، واحصل على البيانات المتعلقة بكثافة الإشارة لكل نقطة.