لطخة النقطة الكمية لتقدير البروتينات المستهدفة في محللة الأنسجة

اللطخة النقطية الكمية - أو QDB - هي تقنية مفيدة لتحديد تركيز البروتينات المستهدفة في العينة. بمجرد تثبيت العينة على غشاء بوليمري ، يمكن اكتشاف البروتينات عن طريق النشاف المناعي.

للبدء ، خذ لوحة QDB - صفيحة متعددة الآبار مع غشاء نيتروسليلوز متصل بقاع كل بئر. أضف العينة — محللة الأنسجة التي تحتوي على البروتين المستهدف — في وسط الغشاء داخل البئر.

دع العينة تجف. يرتبط البروتين المستهدف بالغشاء عن طريق التفاعلات غير التساهمية.

أضف حجب الحظر. تلتصق البروتينات الموجودة في المحلول بالمواقع غير المرتبطة على الغشاء ، مما يمنع الارتباط غير المحدد لكواشف الكشف.

بعد ذلك ، أضف محلولا يحتوي على أجسام مضادة أولية ترتبط بالبروتين المستهدف في العينة. يغسل لإزالة الأجسام المضادة غير المرتبطة.

ثم أضف محلول الأجسام المضادة الثانوية. ترتبط هذه الجزيئات - المسمى بإنزيم البيروكسيديز - بالأجسام المضادة الأولية المرتبطة بالبروتين. يغسل لإزالة الأجسام المضادة غير المرتبطة.

أخيرا ، أضف محلولا يحتوي على ركيزة كيميائية وبيروكسيد الهيدروجين. باستخدام بيروكسيد الهيدروجين ، يؤكسد بيروكسيداز الأجسام المضادة الركيزة وينبعث منها الضوء. باستخدام قارئ اللوحة ، قم بقياس شدة تلألؤ العينة.

قم بإنشاء منحنى تلألؤ قياسي باستخدام تخفيف تسلسلي بتركيزات معروفة من البروتين المستهدف. ارسم قيمة التلألؤ المقاسة للعينة على المنحنى لتحديد تركيز البروتين المستهدف.

في هذا الإجراء، ضع صندوقا فارغا لطرف الماصة أسفل لوحة QDB لتجنب ملامسة الجزء السفلي من اللوحة لسطح الطاولة. قم بتحميل ما يصل إلى 2 ميكرولتر من العينة إلى مركز الغشاء في الجزء السفلي من وحدة فردية من لوحة QDB.

لا تسمح أبدا لأسفل لوحة QDB بلمس أي سطح ، أثناء التحميل ، ولا تقم بتحميل الكثير للبئر الفردي. أنت لا تعاني من أكثر من 4 ميكرولتر لكل بئر.

بعد ذلك ، اترك لوحة QDB المحملة لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة ، أو اترك اللوحة المحملة عند 37 درجة مئوية لمدة خمس عشرة دقيقة في مكان جيد التهوية. لسد اللوحة ، اغمس لوحة QDB في مخزن النقل ورجها برفق لمدة 10 ثوان.

بعد ذلك ، اشطف لوحة QDB برفق باستخدام TBST ثلاث مرات ثم اغسل الطبق لمدة خمس دقائق في TBST تحت الاهتزاز المستمر. بعد ذلك ، قم بحظر لوحة QDB بمخزن مؤقت للحجب لمدة ساعة واحدة تحت الاهتزاز المستمر. الآن ، قم بتخفيف الجسم المضاد الأساسي في المخزن المؤقت المانع بتركيز مختار ، وأضف 100 ميكرولتر منه إلى كل بئر فردي من صفيحة عادية مكونة من 96 بئرا.

أدخل لوحة QDB في اللوحة المكونة من 96 بئرا ، واحتضن الألواح المدمجة إما لمدة ساعتين في درجة حرارة الغرفة ، أو طوال الليل عند 4 درجات مئوية تحت الاهتزاز المستمر. بعد ذلك ، اشطف الطبق برفق باستخدام TBST ثلاث مرات ، قبل غسله باستخدام TBST ثلاث مرات - كل مرة لمدة خمس دقائق تحت الاهتزاز المستمر.

بعد ذلك ، قم بتخفيف الجسم المضاد الثانوي في المخزن المؤقت المانع بالتركيز المختار وقم بإخراج 100 ميكرولتر في كل بئر من صفيحة 96 بئرا. بعد ذلك ، قم باحتضان لوحة QDB داخل اللوحة المحملة بسعة 96 بئرا لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة تحت الاهتزاز المستمر. اشطف لوحة QDB برفق ثلاث مرات باستخدام TBST ، ثم اغسل الطبق ثلاث مرات ، خمس دقائق لكل منها باستخدام TBST تحت الاهتزاز المستمر.

للقياس الكمي ، قم بإعداد ركيزة ECL وحصة في صفيحة 96 بئرا عند 100 ميكرولتر لكل بئر. بعد ذلك ، أدخل لوحة QDB داخل اللوحة المكونة من 96 بئرا لمدة دقيقتين تحت الاهتزاز المستمر. بعد ذلك ، قم بإزالة لوحة QDB من اللوحة المكونة من 96 بئرا ورجها لفترة وجيزة لإزالة السائل الزائد. بعد ذلك ، ضع اللوحة على صفيحة ميكروتيتر بيضاء. بعد ذلك ، قم بتشغيل قارئ اللوحة الدقيقة وحدد اللوحة ذات الغطاء على واجهة المستخدم ، قبل وضع اللوحات المدمجة داخل قارئ اللوحة الدقيقة للقياس الكمي.