النشاف الغربي الكمي لتقدير مستويات التعبير عن البروتين

النشاف الغربي الكمي - تقنية قائمة على تطبيع البروتين الكلي - مفيدا في تحديد مستويات التعبير عن البروتين المستهدفة.

للبدء ، قم بتحميل محللات الأنسجة في آبار هلام التدرج متعدد الأكريلاميد. يحتوي المحللة على البروتين المستهدف ، إلى جانب البروتينات الخلوية الأخرى.

قم بتشغيل الجل بجهد مناسب للفصل الكهربائي لبروتينات العينة على طول التدرج. عند الانتهاء ، ضع الجل فوق الغشاء البوليمري لمكود النقل.

ضع تيارا كهربائيا لنقل البروتينات المنفصلة إلى الغشاء. بعد ذلك ، ضع الغشاء في بقعة بروتين فلورية كاملة. ترتبط جزيئات الصبغة المشحونة في البقعة إلكتروستاتيكيا بجميع البروتينات الموجودة على الغشاء.

أضف حجب الحظر. وبالتالي ترتبط البروتينات الموجودة في المحلول بالغشاء. منع الارتباط غير المحدد لكواشف الكشف. أضف جسما مضادا أساسيا مرتبطا بالبروتين المستهدف فقط. بعد ذلك، أضف جسما مضادا ثانويا — مسمى بالفلوروفور — يرتبط بالجسم المضاد الأساسي.

إثارة العينة بالليزر. سجل التألق المنبعث من جزيئات الصبغة لصبغة البروتين الكلية والفلوروفورات المرتبطة بالأجسام المضادة بأطوال موجية مقابلة.

لحساب قيمة تحميل البروتين الطبيعي ، اقسم إجمالي إشارة البروتين لكل حارة على أعلى قيمة. اقسم إشارة البروتين المستهدف على قيمة التحميل الطبيعية المقابلة لتحديد التعبير النسبي للبروتين المستهدف.

بالنسبة للرحلان الكهربائي ، قم بإعداد هلام متدرج مسبق الصب بنسبة 4 إلى 12٪ Bis-Tris في نظام غرفة الرحلان الكهربائي للهلام ، وقم بتحميل 3.5 ميكرولتر من معيار البروتين في البئر. عند استخدام معيار داخلي لتطبيع الغشاء بين ، قم بتحميل كمية تساوي العينات الأخرى في الآبار الثلاثة الأولى بجوار سلم البروتين ، وقم بتحميل 30 ميكروغراما من كل عينة في الآبار المتبقية. بعد ذلك ، قم بتشغيل العينات من خلال جل التكديس عند 80 فولت لمدة 10 دقائق متبوعا ب 150 فولت لمدة 45 إلى 60 دقيقة إضافية.

في نهاية الرحلان الكهربائي ، لتجميع كومة النقل ، ضع هلام البروتين على المكدس السفلي الذي يحتوي على غشاء ثنائي فلوريد البولي فينيلدين متبوعا بورق الترشيح. استخدم أسطوانة النشاف لإزالة أي فقاعات هواء، وضع المكدس العلوي أعلى ورق الترشيح، قبل دحرجة المكدس مرة أخرى لإزالة فقاعات الهواء.

انقل المكدس بالكامل إلى جهاز النقل باستخدام القطب الكهربائي الموجود على الجانب الأيسر من الجهاز وضع إسفنجة الجل أعلى المكدس ، بحيث تتم محاذاة الإسفنجة مع جهات الاتصال الكهربائية المقابلة على الجهاز.

بعد إغلاق الغطاء ، حدد البرنامج المناسب وابدأ تشغيله. في نهاية البرنامج ، قم بقص الغشاء إلى حجم الجل ، واغسل الغشاء المقطوع بسرعة بالماء المقطر المزدوج قبل الاستمرار في بقعة البروتين الكاملة.

للحصول على تلطيخ البروتين الكلي ، قم بلف الغشاء في أنبوب سعة 50 مليلتر بحيث يكون جانب البروتين متجها للداخل وقم بتسمية الغشاء ب 5 مل من محلول بقع البروتين على الأسطوانة لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة في غطاء الدخان.

في نهاية الحضانة ، اغسل الغشاء بسرعة باستخدام 5 مل من محلول الغسيل ، وأعد الأنبوب لفترة وجيزة إلى الأسطوانة بين الغسلات ، متبوعا بشطف قصير بالماء فائق النقاء. أضف 3 ملليمترات من المخزن المؤقت المانع إلى الغشاء ، وأعد الغشاء إلى الأسطوانة لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. استبدل المخزن المؤقت المانع بالجسم المضاد الأساسي ذي الأهمية بالتركيز الأمثل المناسب ، واحتضان الغشاء على الأسطوانة طوال الليل عند 4 درجات مئوية.

في اليوم التالي ، اغسل الغشاء 6 مرات لمدة 5 دقائق باستخدام 5 مل من PBS الطازج لكل غسلة على الأسطوانة في درجة حرارة الغرفة. بعد الغسيل الأخير ، احتضن الغشاء بمحلول الجسم المضاد الثانوي المناسب على الأسطوانة لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة متبوعا ب 3 غسلات لمدة 30 دقيقة لكل غسلة. بعد الغسيل الأخير ، جفف الغشاء واستخدم ورق الألمنيوم للحفاظ على الغشاء محميا من الضوء.

للحصول على الصور ، ضع الغشاء على الماسح الضوئي بحيث يكون جانب البروتين متجها لأسفل وحدد منطقة المسح في البرنامج. ثم احصل على الصور في كلتا القناتين وقم بتصدير الصور إلى برنامج تحليل الصور المناسب.

اعرض القناة التي تبلغ وزنها 700 نانومتر لإظهار نتيجة تلطيخ البروتين الإجمالية ، وحدد "تحليل" وارسم مستطيلا لتحديد منطقة الاهتمام بالتطبيع. بعد ذلك ، انسخ ولصق منطقة المستطيل الأولى على كل عينة على حدة للتأكد من أن المنطقة المحددة بنفس الحجم لجميع الممرات التي تم تحليلها.

لتحديد تركيز البروتين في كل حارة ، انسخ النتائج من كل من صبغة البروتين الكلية والبروتين المعني إلى برنامج جدول بيانات ، وحدد أعلى إشارة إجمالية لصبغة البروتين. ثم اقسم كل قيمة إشارة إجمالية لصبغة البروتين على هذه القيمة للحصول على قيمة تحميل البروتين الطبيعي ، واقسم قيمة إشارة 800 نانومتر من كل عينة فردية على قيمة البروتين الطبيعية المقابلة لها لحساب نسبة تعبير البروتين النسبي في عينات مختلفة.