النشاف الغربي أحادي الخلية لتحديد عدم تجانس الخلية

تحتوي

مواقع الالتهاب على خلايا مناعية مختلفة ، بما في ذلك الخلايا الوحيدة والضامة والكريات البيض.

لتحديد مجموعة الخلايا غير المتجانسة عن طريق النشاف الغربي أحادي الخلية ، خذ شريحة نشاف مرطبة مسبقا ، تتكون من هلام بولي أكريلاميد قابل للتنشيط الضوئي منقوش في كتل. تحتوي كل كتلة على العديد من الآبار الصغيرة. يلتقط الزخرفة في عدة كتل خلايا متعددة بالتوازي.

أضف معلقا يحتوي على مجموعة خلايا غير متجانسة. تسمح أبعاد البئر للخلايا المفردة بالاستقرار. اغمر الشريحة في غرفة الرحلان الكهربائي مملوءة بمخزن مؤقت مناسب. تعمل جزيئات المنظفات الموجودة في المخزن المؤقت على تعطيل غشاء الخلية ، وتطلق محتويات خلوية.

تطبيق مجال كهربائي. تهاجر البروتينات المنبعثة عبر الهلام ، وتنقسم إلى نطاقات مميزة الحجم. اغسل الشريحة بمخزن مؤقت للغسيل لإزالة الجزيئات غير المرتبطة على وجه التحديد ، مع ترك البروتينات الخلوية فقط ، بما في ذلك بروتينات العلامات المطلوبة.

قم بتعريض الجل للأشعة فوق البنفسجية ، وتنشيط سطحه وشل حركة البروتينات.

أضف مزيجا من الأجسام المضادة الأولية التي ترتبط على وجه التحديد ببروتينات العلامات المميزة لكل نوع من أنواع الخلايا ، وتشكل مجمعات الأجسام المضادة الأولية للبروتين. استغن عن مزيج من الأجسام المضادة الثانوية ذات العلامات الفلورية ، والتي تربط الأجسام المضادة الأولية الخاصة بها ، مع تسمية بروتين العلامة الخاص بالخلية المقابل.

ضع الشريحة في ماسح ضوئي. قم بقياس شدة التألق التي تتناسب مع مستوى التعبير عن علامة البروتين المقابلة الخاصة بخلية واحدة من معلق خلية العينة.

لتحليل اللطخة الغربية أحادية الخلية ، أضف 1 مليلتر من المعلق أحادي الخلية المخفف إلى شريحة لطخة غربية أحادية الخلية المعاد ترطيبها في قاع طبق بتري بطول 10 سم. بعد خمس إلى خمس عشرة دقيقة ، افحص الشريحة تحت الفحص المجهري الساطع. يجب أن تشغل خلية واحدة ما يقرب من 15٪ إلى 20٪ من الآبار الصغيرة ، ويجب أن يحتوي أقل من 2٪ من الآبار على خليتين أو أكثر.

إذا تم تحميل الشريحة بشكل صحيح ، فقم بإمالة الطبق 45 درجة ، واغسل الرقاقة ثلاث مرات باستخدام عازلة التعليق لإزالة أي خلايا غير ملتقطة. بعد الغسيل الأخير ، قم بتحميل الشريحة بعناية في خلية الرحلان الكهربائي لجانب هلام أداة غربية أحادية الخلية لأعلى ، وقم بتغطية شريحة اللطخة الغربية أحادية الخلية بالكامل بمحلول تحلل / تشغيل. ابدأ تحلل الخلية وقم بتشغيل الجهاز وفقا لمعايير التجربة المناسبة.

في نهاية الجري ، اشطف الرقاقة بغسلتين لمدة 10 دقائق مع مخزن غسيل طازج لكل غسلة في درجة حرارة الغرفة. بعد الغسيل الثاني ، أضف 80 ميكرولترا من محلول الجسم المضاد الأساسي ذي الأهمية إلى غرفة فحص الأجسام المضادة وقم بخفض جانب هلام الرقاقة لأسفل بحيث يفتيل محلول الجسم المضاد عبر الشريحة.

بعد ساعتين في درجة حرارة الغرفة ، اغسل الرقاقة ثلاث مرات في مخزن الغسيل ومرة واحدة في الماء على شاكر. احتضان الرقاقة بجسم مضاد ثانوي مناسب لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة ، محمي من الضوء. في نهاية الحضانة ، اغسل الرقاقة ثلاث مرات باستخدام عازلة الغسيل ، وقم بتدوير الرقاقة على دوار منزلق لإزالة أي مخزن مؤقت للغسيل المتبقي.

لتجريد شريحة اللطخة الغربية أحادية الخلية ، ضع رفا أنبوبيا سعة 50 مليلتر في حمام مائي بدرجة حرارة 60 درجة مئوية مع الماء على ارتفاع 1 سم فقط فوق الرف. في غطاء الدخان ، أضف 40 مل من عازلة التجريد ، و 320 ميكرولترا من بيتا ميركابتو إيثانول إلى العلبة. ضع الشريحة في طبق بتري بطول 10 سم داخل العلبة وأغلق العلبة بالبارافيلم

ثم ضع العلبة داخل رف الأنبوب في الحمام المائي. بعد 90 دقيقة ، انقل الشريحة بعناية إلى طبق بتري جديد ، واغسل الشريحة لفترة وجيزة مرة واحدة باستخدام عازلة الغسيل قبل إضافة 15 مل من مخزن الغسيل الطازج إلى طبق بتري لغسل لمدة 15 دقيقة على شاكر.