فحص اللطخة الغربية المضيئة الكيميائية لمعالجة البروتين

يرتبط CD95 - مستقبل الموت - بأجسامه المضادة الناهضة ، مما يؤدي إلى تجميع مركب إشارات محفز للموت ، أو DISC - مركب متعدد البروتينات يجند بروكاسباز 8. في DISC ، يقوم procaspase 8 بتعالج لتشكيل العديد من منتجات الانقسام الوسيط ، وأخيرا ، شكل نشط يبدأ موت الخلايا المبرمج.

لتحليل معالجة caspase-eight باستخدام النشاف الغربي الكيميائي ، خذ محللة تحتوي على منتجات الانقسام الوسيط المرتبطة بالقرص من caspase 8 في أنبوب. استكمل هذا بالأجسام المضادة للبروتين A-agarose المضادة ل CD95 التي تم التقاطها بواسطة حبة A-agarose. ترتبط الأجسام المضادة ل CD95 بمكون DISC - CD95 ، وتشكل مجمعات البروتين.

قم بتحميل العينة على جل SDS-polyacrylamide لفصل المواد الوسيطة من الكاسباز 8 المترسبة المناعية ذات الأحجام المختلفة كنطاقات متميزة. ضع الجل على غشاء نشاف ، وقم بتطبيق التيار الكهربائي. تتحرك المواد الوسيطة الكاسباز 8 من الجل إلى غشاء النشاف.

عالج الغشاء بمحلول حاجب يحتوي على البروتين لتشبع مواقع ربط البروتين - مما يمنع الارتباطات غير المحددة.

أضف محلولا من الأجسام المضادة الأولية ، والتي ترتبط بمنتجات الكاسباز ثمانية في موقع معين.

أضف الأجسام المضادة الثانوية الموسومة بالإنزيم والتي ترتبط على وجه التحديد بمنطقة Fc التكميلية للجسم المضاد الأساسي لتشكيل مركب الأجسام المضادة الثانوية لمنتج الانقسام الثماني من ا