اللطخة الشمالية للكشف عن الحمض النووي الريبي الصغير المحدد وتحديده في مستخلص الحمض النووي الريبي الكلي للأنسجة النباتية

MicroRNAs ، miRNAs ، هي RNAs صغيرة ، أحادية الشريطة ، غير مشفرة. يندمج miRNA في مركب متعدد البروتينات ويرتبط بشكل أكبر بتسلسلات mRNA المستهدفة التكميلية لتنظيم التعبير الجيني سلبا.

للكشف عن miRNA معين من إجمالي الحمض النووي الريبي من الأنسجة النباتية ، أضف صبغة محملة بالهلام تحتوي على أصباغ تتبع وفورماميد - عامل تغيير طبيعة الحمض النووي الريبي. قم بتسخين العينة لتشويه طبيعة الحمض النووي الريبي ومنع تكوين الهيكل الثانوي قبل الرحلان الكهربائي.

قم بتحميل العينة وعلامات الحمض النووي الريبي القياسية في آبار من هلام بولي أكريلاميد متغير الطبيعة المجمع مسبقا. قم بتشغيل الرحلان الكهربائي ، مما يسهل الفصل القائم على الحجم لشظايا الحمض النووي الريبي.

انقل الجل إلى أوراق ترشيح مبللة مسبقا على علبة نشاف كهربائي. قم بمحاذاة غشاء نشاف النايلون المنقوع بالعازلة فوق الجل. ثم قم بتكديس أوراق الترشيح المبللة مسبقا. إجراء النشاف الكهربائي.

يتسبب التيار الكهربائي في خروج الحمض النووي الريبي سالب الشحنة ، بما في ذلك miRNA ، من الجل إلى سطح غشاء النايلون موجب الشحنة. تعريض الغشاء للأشعة فوق البنفسجية. هذا يربط الحمض النووي الريبي بالغشاء ، وبالتالي يمنع فقدان الحمض النووي الريبي.

احتضان الغشاء في مخزن مؤقت للتهجين يحتوي على عوامل مانعة تشغل مواقع الربط غير المحددة لتقليل ضوضاء الخلفية.

أضف مسبار قليل النوكليوتيد الحمض النووي الريبي ذي العلامات الإشعاعية مكملا ل miRNA المستهدف للارتباط به على وجه التحديد. اغسل الغشاء بالعازلة ، وقم بإزالة المجسات غير المرتبطة.

استخدم نظام التصوير الفوسفوري لاكتشاف شدة إشارة التهجين الإشعاعي وتحديدها. تشير الإشارة عالية الدقة إلى تعبير miRNA محدد في الأنسجة النباتية.

توقف عن التشغيل المسبق للجل.

اغسل الآبار جيدا قبل تحميل العينة لإزالة رواسب اليوريا داخل الآبار. تسخين عينات الحمض النووي الريبي المعلقة عند 98 درجة لمدة دقيقة واحدة. قم بتحميل العينات الساخنة في الآبار باستخدام أطراف شعرية. تجنب إدخال فقاعات الهواء.

التحميل الكامل لجميع العينات وتجميع الغطاء. قم بتشغيل الجل على حرارة 80 فولت لمدة 3 ساعات ، أو حتى يعمل اللون الأزرق البروموفينول تماما. استخدم غشاء نايلون موجب الشحنة للنقل. اقطعها إلى أبعاد اللوحة الزجاجية. قم بتسمية الغشاء في الزاوية اليمنى العليا. ضع الغشاء برفق على سطح ماء Milli-Q المعقم. تأكد من وضع جانب الملصق لأسفل في مواجهة سطح الماء.

خذ صينية نظيفة وقم بإعداد شطيرة الجل للنقل الكهربائي. ضع الجانب الرمادي من الكاسيت لأسفل. صب 1X TBE أعلى بقليل من مستوى الكاسيت. قم بترطيب وسادة الألياف مسبقا في 1X TBE ، واضغط عليها لإزالة فقاعات الهواء. قطع قطعتين من ورق النشاف بحجم وسادة الألياف.

قم ببللة قطعة من ورق النشاف مسبقا في 1X TBE ، وضعها فوق وسادة الألياف. قم بإزالة فقاعات الهواء عن طريق لف ماصة بلاستيكية فوق الورق. قم ببللة قطعة أخرى من ورق النشاف مسبقا في 1X TBE وضعها فوق الكاسيت. الانقلاب لإزالة فقاعات الهواء. الآن إعداد الساندويتش جاهز للنقل الكهربائي.

بعد الانتهاء من الرحلان الكهربائي ، أوقف الجري وقم بإزالة الغطاء من الجهاز. قم بإزالة الكاسيت قيد التشغيل من الإعداد. أخرج الألواح الزجاجية من الكاسيت الجاري.

قم بإزالة الجل بعناية من التجميع. ضعه فوق ورق النشاف بحيث تكون عينة الحمض النووي الريبي المحملة الأولى باتجاه يمينك. اغمس الغشاء المنقوع مسبقا برفق في 1X TBE وضعه فوق الجل المواجه لجانب الملصق لأسفل. لا تدع الغشاء والهلام يجفان. تدحرج برفق لإزالة فقاعات الهواء.

اغمس قطعة واحدة من ورق النشاف في 1X TBE ، وضعها فوق الغشاء. قم بإزالة فقاعات الهواء. ضع قطعة أخرى من ورق النشاف ، وقم بإزالة فقاعات الهواء. أكمل الساندويتش عن طريق وضع وسادة الألياف فوق التجميع. أغلق الكاسيت بإحكام.

ضع كاسيت transblot في الوحدة. املأ الخزان ب 1X TBE ، درجة الحموضة 8.2 ، حتى علامة النشاف. أغلق غطاء الجهاز وانقله عند 10 فولت طوال الليل عند 4 درجات أو في غرفة باردة. حافظ على الرابط المتقاطع للأشعة فوق البنفسجية جاهزا واضبطه على 1,200 قبل الانتهاء من النقل الكهربائي مباشرة.

بعد الانتهاء من النقل ، قم بإزالة الكاسيت من الوحدة. ضع الغشاء الرطب على ورقة A4 مع وضع الجانب المحدد لأعلى. ربط الحمض النووي الريبي بالغشاء عن طريق التشعيع بضوء الأشعة فوق البنفسجية 254 نانومتر عند 120 مللي جول. يمكن تخزين اللطخة المتشابكة عند 4 درجات أو استخدامها للتهجين.

صمم مسبارا مكملا تماما للحمض النووي الريبي الصغير الذي يجب اكتشافه ، وقم بتسمية المسبار في نهايته الأولية 5 باستخدام إنزيم PNK ، واجمع المكونات كما هو موضح. احتضن خليط التفاعل عند 37 درجة لمدة 30 دقيقة.

بعد 30 دقيقة من الحضانة ، استخدم أعمدة G-25 لفصل المجسات غير المسماة عن خليط التفاعل. لتحسين وضع العلامات على المسبار ، قم بإعداد عمود G-25 قبل الاستخدام. ضع اللطخة ، بحيث يكون جانب الحمض النووي الريبي متجها للجزء العلوي ، داخل زجاجة تهجين. امزج المخزن المؤقت للتهجين بقوة قبل الاستخدام. أضف 10 مل من المخزن المؤقت للتهجين ، وضع زجاجة التهجين داخل فرن تهجين يتم الحفاظ عليه عند 35 درجة مع الدوران.

قم بإجراء التهجين المسبق لمدة 20 إلى 30 دقيقة. بعد التهجين المسبق ، أخرج الزجاجة من الفرن. أضف المسبار المسمى إلى المخزن المؤقت للتهجين برفق. تأكد من عدم إنشاء فقاعات الهواء. احتضن اللطخة داخل الفرن على حرارة 35 درجة مع الدوران لمدة 12 ساعة.

بعد التهجين ، قم بإزالة المخزن المؤقت للتهجين من الزجاجة. قم بإجراء غسيل سريع للبقع باستخدام عازلة الغسيل I. يتم تنفيذ هذه الخطوة لإزالة محلول التهجين الزائد من البقط. علاوة على ذلك ، قم باحتضان البقع عند 35 درجة لمدة 30 دقيقة باستخدام مخزن الغسيل I. قم بإجراء غسيل آخر باستخدام المخزن المؤقت II عند 35 درجة لمدة 30 دقيقة.

بعد غسل البقعة ، ضعها داخل غطاء تهجين ، وقم بإزالة المخزن المؤقت الزائد ، وأغلقها. ضعه داخل كاسيت ، وقم بتعريضه لشاشة تصوير فوسفور خالية من الإشعاع لمدة 12 ساعة. اكتشف إشارة التهجين باستخدام Typhoon Biomolecular Imager وقم بتحليل النتائج باستخدام برنامج ImageJ.