الاستشعار الحيوي للتأثير الميداني القائم على المستشعر الحيوي للجرافين للكشف عن تفاعلات البروتين والبروتين

تفاعلات البروتين والبروتين ، PPIs ، ضرورية في تنظيم معظم العمليات البيولوجية.

للكشف عن PPIs باستخدام الاستشعار الحيوي للتأثير الميداني ، ابدأ بشريحة ترانزستور تأثير مجال الجرافين. تتكون الشريحة من سطح الجرافين الوظيفي بالكربوكسيل كقناة شبه موصلة بين أقطاب المصدر والتصريف.

احتضان الرقاقة بمحلول جديد من carbodiimide و N-hydroxysulfosuccinimide ، sulfo-NHS ، في مخزن مؤقت zwitterionic. يخلق هذا المخزن المؤقت درجة حموضة مناسبة ، مما يمكن carbodiimide و sulfo-NHS من تنشيط مجموعات الكربوكسيل الوظيفية للرقاقة ، وتشكيل استرات تفاعلية مع الأمين.

أضف محلول البروتين المستهدف. تتفاعل الأمينات الأولية مع الإسترات المتفاعلة مع الأمين ، مما يؤدي إلى شل حركة البروتينات الموجودة على الرقاقة من خلال تكوين رابطة أميد. أضف محلول التبريد المحتوي على الأمين لمنع استرات الأمين التفاعلية غير المرتبطة ، مما يمنع الارتباط غير المحدد.

أدخل الشريحة في القارئ الإلكتروني وقم بمعايرتها باستخدام مخزن مؤقت. يطبق القارئ جهدا ثابتا بين الأقطاب الكهربائية. يتم قياس تدفق التيار الكهربائي الناتج بين الأقطاب الكهربائية في حالة التحليل غير المرتبط.

أضف أقل تركيز للتحليل الكيميائي. يغير التفاعل بين البروتينات التحليلية والأهداف المثبتة على الرقاقة توزيع الشحنة المحلية لسطح الجرافين ، المسجل على أنه استجابة I - التغيير في تدفق التيار بين الأقطاب الكهربائية.

بعد التسجيل ، اغسل بمخزن مؤقت لفصل التحليلات المقلدة. كرر التحليل مع زيادة تركيزات التحليل

الزيادة التدريجية في الاستجابة I مع زيادة تركيزات التحليل إلى وجود مؤشرات PPI قوية بين الهدف والمقطع التحليلي.

ابدأ بخلط كميات متساوية من محلول EDC و sulfo-NHS عن طريق سحب العينات لأعلى ولأسفل. ضع رقائق المستشعر الحيوي التي توفرها الشركة في طبق بتري زجاجي بغطاء مناسب. يقترح إجراء جميع خطوات الوظيفية المتضمنة في تنشيط الرقاقة داخل طبق بتري. ضع 50 ميكرولترا من 1 مولي MES على شريحة المستشعر الحيوي. احتضن لمدة 1 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.

بعد ذلك ، قم بشفط المخزن المؤقت وقم بتطبيق 50 ميكرولترا من محلول EDC / sulfo-NHS على الفور على شريحة المستشعر. غطي طبق بتري واحتضنه لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. استنشق محلول EDC / sulfo-NHS من الشريحة ، وقم بتطبيق 50 ميكرولتر من 1 عازلة MES مولارية.

قم بشفط المخزن المؤقت MES واشطف الرقاقة مرتين باستخدام 50 ميكرولتر من 1x PBS. قم بشفط PBS من الرقاقة ، وأضف الجزيء المستهدف Hsp90. غطي طبق بتري الزجاجي ، واحتضنه لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. بعد ذلك ، قم بشفط المحلول الذي يحتوي على الجزيء المستهدف ، واشطفه ثلاث مرات باستخدام 50 ميكرولتر من 1x PBS.

استنشق محلول 1x PBS من الشريحة ، وأضف 50 ميكرولترا من محلول Quench 1. غطي طبق بتري الزجاجي واحتضنه لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. استنشق محلول التبريد 1 من الشريحة ، وأضف 50 ميكرولترا من محلول Quench 2. غطي طبق بتري الزجاجي واحتضنه لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. بعد ذلك ، قم بشفط محلول التبريد 2 من الشريحة ، واشطف الرقاقة خمس مرات باستخدام 50 ميكرولتر من 1X PBS تاركا آخر قطرة PBS على المستشعر.

قم بإعداد سلسلة التخفيف التحليلي ل Cdc37 في نطاق التركيز المطلوب. صمم التجربة لتشمل ما لا يقل عن ثمانية تركيزات تحليلية مختلفة للحصول على ثابت تفكك موثوق به أو قيمة_Kd ، وإعداد هذه التخفيفات المختلفة في نفس المخزن المؤقت المستخدم للمعايرة والبروتين المستهدف.

ضع الرقاقة بعناية في الجهاز. تأكد من تشغيل البرنامج وأن ضوء LED يتحول إلى اللون الأخضر. بعد ذلك ، اضغط على وحدة "تشغيل التجربة" على البرنامج الآلي واختر "10 نقاط مع التجديد" أو أي بروتوكول آخر مطلوب. املأ التفاصيل، مثل اسم المشغل، واسم التجربة، والتاريخ، والمخزن المؤقت للتجديد، والهدف الثابت، والتحليل في الحل. اضغط على زر "بدء التجربة" المعروض على البرنامج ، واتبع التعليمات التي يعرضها البرنامج الآلي.

لإجراء معايرة الجهاز ، قم بشفط محلول PBS المتبقي من الشريحة وقم بتطبيق 50 ميكرولترا من المخزن المؤقت للمعايرة. اضغط على زر "متابعة" وانتظر لمدة خمس دقائق حتى تنتهي خطوة المعايرة. يعرض البرنامج نقطة النهاية المحددة لخطوة المعايرة مع إنذار تحذير للمتابعة.

بعد ذلك ، قم بإجراء ارتباط التحليل عن طريق شفط المخزن المؤقت للمعايرة من الرقاقة وتطبيق 50 ميكرولترا من أقل تركيز للتحليل الكيميائي. اضغط على زر "متابعة" وانتظر لمدة خمس دقائق حتى تنتهي خطوة الاقتران. يعرض البرنامج نقطة النهاية لخطوة الاقتران مع إنذار تحذير للمتابعة.

لإجراء تفكك التحليل ، قم بشفط محلول التحليل من الرقاقة وقم بتطبيق 50 ميكرولترا من المخزن المؤقت للتفكك. اضغط على زر "متابعة". بعد مدة خطوة التفكك، يعرض البرنامج نقطة النهاية لخطوة التفكك مع إنذار تحذير.

بعد ذلك ، قم بإجراء تجديد الرقاقة عن طريق شفط محلول التفكك من الشريحة ، وتطبيق 50 ميكرولترا من المخزن المؤقت للتجديد. ثم اضغط على زر "متابعة". تستغرق خطوة التجديد عادة حوالي 30 ثانية حتى تنتهي. بعد ذلك ، يعرض البرنامج نقطة النهاية لخطوة التجديد مع إنذار التحذير للمتابعة.

أخيرا ، لغسل الرقاقة ، قم بشفط محلول التجديد من الشريحة ، وقم بتطبيق 50 ميكرولتر من مخزن الغسيل. استنشق المحلول من الرقاقة وكرر ذلك خمس مرات. اترك آخر قطرة من مخزن الغسيل على الشريحة. ثم اضغط على زر "متابعة" وانتظر لمدة 30 ثانية حتى تنتهي مدة خطوة الغسيل في شاشة البرنامج.

كرر الخطوات لكل تركيز تحليلي مستخدم. تشكل الخطوات الخمس للمعايرة ، وارتباط التحليل ، والتفكك ، والتجديد ، والغسيل خمس مرات دورة واحدة.