لماذا يعد قياس عمر الفلورة مهماً للتحقق من صحة الهدف؟

يؤكد انخفاض عمر الفلورة للمانح كفاءة FRET، مما يوفر دليلاً كمياً على التفاعلات بين البروتينات في البكتيريا الحية. ويدعم هذا القياس التحقق من الهدف من خلال التمييز بين الارتباط النوعي والتوضع المشترك العشوائي. كما يوفر هذا النهج تقليلاً للمخاطر الميكانيكية من خلال بيانات تفاعل موضوعية قائمة على عمر الفلورة.

كيف يدعم عزل البروتينات الفلورية المانحة والمستقبلة مسار عملية الاكتشاف؟

يسمح استخدام eGFP كمانح و mCherry كمستقبل بالكشف النوعي عن FRET عندما تؤدي البروتينات المتفاعلة إلى تقريب الفلوروفورات من بعضها البعض. يضمن هذا الفصل أن التغيرات الملحوظة في عمر الفلورية تعكس تفاعلات جزيئية حقيقية بدلاً من التداخل الطيفي (spectral bleed-through). وتتناسب هذه الاستراتيجية مع مراحل الاكتشاف المبكرة من خلال توفير قراءة موثوقة لارتباط الهدف في الأنظمة البكتيرية الحية.

ما هي قياسات المتغيرات التابعة الكمية التي تتيح تقييم التفاعل؟

يعمل متوسط عمر الفلورة للبروتين المانح (eGFP) كمتغير تابع كمي، حيث تشير الانخفاضات إلى حدوث FRET. وتسمح هذه القياسات بمقارنة قوة التفاعل عبر عينات بكتيرية من النوع البري، أو المتحورة، أو المحددة بحالة معينة. وتدعم هذه النتائج تطوير المقايسات من خلال تقديم بيانات عددية مستمرة لفحص التفاعلات.

لماذا تهم متطلبات التكرار في التعاون متعدد الوظائف؟

يضمن تصوير ما بين 10 إلى 30 بكتيريا غير متحركة في كل مجال رؤية توفير قوة إحصائية كافية لقياسات عمر دقيقة. يتيح معيار التكرار هذا تبادلاً متسقاً للبيانات بين فرق بيولوجيا الاكتشاف، وتطوير المقايسات، والفرق قبل السريرية. كما يدعم أخذ العينات المتسق التوافق بين الوظائف المختلفة فيما يتعلق بعتبات التحقق من التفاعل.

ما هي إمكانيات التحليل الإحصائي المطلوبة قبل التنفيذ؟

يجب أن تكون الفرق قادرة على قياس التغيرات في عمر الفلورة وتقييم الدلالة الإحصائية للانخفاضات الناتجة عن FRET. يتطلب التحليل مقارنة قيم عمر المانح بين مجموعات الضبط المتفاعلة وغير المتفاعلة لتأكيد الارتباط النوعي للبروتين. تضمن هذه القدرات إمكانية استخدام بيانات FLIM-FRET بثقة في اتخاذ قرارات التحقق من الهدف.

تصوير FLIM-FRET لتوصيف تفاعلات البروتين والبروتين في البكتيريا الحية

JoVE Encyclopedia of Experiments

التقنيات البيولوجية

0 مشاهدات • 4:26 د • July 8th, 2025

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

لدراسة تفاعلات معينة بين البروتين والبروتين في البكتيريا الحية باستخدام الفحص المجهري للتصوير مدى الحياة الفلورية ، يبدأ FLIM ، جنبا إلى جنب مع نقل طاقة رنين Förster ، FRET ، بتعليق بكتيري مؤتلف. تعبر البكتيريا عن بروتينات سيتوبلازمية محددة تشارك في مسارات التمثيل الغذائي ، وتسمى بروتينات الفلورسنت المانحة والمتقبلة المناسبة ل FRET.

اكتشف المعلق البكتيري على وسادة الاغاروز ، مما يشل حركة البكتيريا على شريحة مجهرية. ضع غطاء على الشريحة وختمها.

ضع الشريحة على مسرح مجهر المسح الضوئي المقلوب للإثارة ثنائية الفوتون للفحص المجهري FLIM-FRET. استخدم مصباح مضان لتحديد ومسح منطقة ذات أهمية على الطبقة الأحادية البكتيرية.

يؤدي التفاعل بين البروتينات السيتوبلازمية المعبر عنها إلى تقريب بروتينات الفلورسنت المانحة والمتلقية في الاتجاه المناسب. عند إضاءة الليزر بطول موجي مناسب ، يصبح البروتين الفلوري المانح متحمسا.

يؤدي القرب الشديد من البروتينات الفلورية إلى تحفيز FRET ، مما يؤدي إلى نقل الطاقة غير الإشعاعية من بروتينات الفلورسنت المانحة إلى البروتينات الفلورية المتقبلة ، والتي تثير وتعود في النهاية إلى الحالة الأرضية ، وتنبعث منها مضانة.

يقلل

نقل الطاقة غير الإشعاعية من الوقت المستغرق لعودة البروتين الفلوري المتبرع المتحمس إلى حالته الأساسية ، وعمر مضان المتبرع - يقاس بواسطة FLIM. يؤكد الانخفاض في متوسط عمر البروتين الفلوري للمتبرع بسبب FRET تفاعل البروتين والبروتين في البكتيريا.

ضع شريحة زجاجية مجهرية على سطح أفقي مستو ، ورتب شريحتين زجاجيتين تعلوهما طبقتان من الشريط اللاصق حولها. ماصة عبارة عن قطرة سعة 70 ميكرولتر من 1٪ من الاغاروز المذاب على الشريحة الزجاجية ، ووضع شريحة رابعة في الأعلى لتسطيح قطرة الاغاروز. اضغط برفق لمدة دقيقة تقريبا.

انزع الشريحة العلوية وقم بإسقاط حوالي ثلاثة ميكرولترات من البكتيريا في ثلاث إلى أربع نقاط في مواقع مختلفة على وسادة الاغاروز. قم بتغطية وسادة الاغاروز بغطاء زجاجي مجهري ، وثبته بالبارافين المذاب لإغلاقه على الشريحة الزجاجية ، بدءا من الزوايا الأربع.

ضع شريحة الفحص المجهري على المسرح ، بحيث يكون الغطاء مواجها للهدف. أدر برج مكعب المرشح لتحديد مكعب eGFP ، وافتح غالق المصباح الفلوري. ثم أرسل ضوء التألق باتجاه عدسة المجهر. ركز الهدف على البكتيريا باستخدام مقبض المجهر.

حدد منطقة الاهتمام في العينة باستخدام عصا التحكم التي تتحكم في المرحلة الآلية. أرسل مسار انبعاث التألق مرة أخرى نحو الكاشف ، ثم أعد برج مكعب المرشح لتحديد المكعب ثنائي اللون لليزر 930 نانومتر ، واضبط طاقة الليزر على 20 مللي واط. اضبط حجم المنطقة محل الاهتمام على 30 ميكرومتر ، والذي يضبط الجهد الذي يعمل على مرايا galvo ويحدد نطاق تحركاتها.

فيديوهات ذات صلة

0 مرات المشاهدة

آخر تحديث: 22 أغسطس 2026

تصوير FLIM-FRET لتوصيف تفاعلات البروتين والبروتين في البكتيريا الحية

نظرة عامة

المكونات الرئيسية للدراسة

مجال العلم

خلفية علمية

الغرض من الدراسة

الطرق المستخدمة

النتائج الرئيسية

الاستنتاجات

الأسئلة الشائعة

الأهمية التنفيذية في الصناعة

التطبيقات الاستراتيجية في البحث والتطوير في مجال الأدوية البيولوجية

الاكتشاف المبكر والتحقق من الهدف

الفحص وتطوير المقايسة

الأبحاث الترجمية وما قبل السريرية

تكامل سير العمل والمسارات التحليلية

التأثير التشغيلي والمؤسسي

اعتبارات التنفيذ

الأسئلة الشائعة حول الصيدلة الحيوية

حساسة للغاية وسريع كشف الإسفار مع محلل الحنق المحمولة

استخدام الأنابيب الفلورية الرنين نقل الطاقة لدراسة ديناميات البروتين المجمعات في مقياس زمني ميلي ثانية

تحديد التفاعل الثلاثي بين اثنين من مونومرات من عامل النسخ MADS مربع وبروتين استشعار الكالسيوم من قبل BiFC-FRET-FLIM المقايسة

التصوير البروتين البروتين التفاعلات في الجسم الحي

الإسفار التكملة ثنائي الجزيء

الحنق المجهر لمراقبة الوقت الحقيقي من أحداث في اشارة الخلايا الحية باستخدام أجهزة الاستشعار Unimolecular

تصور التفاعلات الحمض النووي البروتين في الخلايا البكتيرية عن طريق لايف Photoactivated تتبع جزيء واحدة

البروتين البروتين التفاعلات تصور من قبل ثنائي الجزيء الإسفار التكملة في Protoplasts التبغ وأوراق

التحقيق البروتين البروتين التفاعلات في الخلايا الحية باستخدام الرنين ضوء بارد نقل الطاقة

فائقة الدقة التصوير من Cytokinetic Z الدائري في البكتيريا تعيش طريق سريع منظم 3D الإضاءة المجهري (F3D-SIM)