مقايسة ربط القرب لدراسة تفاعلات البروتين والبروتين في الموقع

ابدأ مقايسة ربط القرب عن طريق أخذ الديدان الخيطية المقطعة وتثبيتها على شريحة مع تعرض خلايا السلالة الجرثومية الخاصة بها. تظهر هذه الخلايا مستويات عالية من مجمعات البروتين النووي الريبي التي تحتوي على بروتينات مرتبطة بالحمض النووي الريبي ، RBPs ، المرتبطة بالبروتينات الشريكة لها.

تراكب الشريحة بجسمين مضادين أساسيين يتعرفان على بروتينين مستهدفين محددين - RBP والبروتين الشريك له. استكمل الشريحة بنوعين من الأجسام المضادة الثانوية الخاصة بالأجسام المضادة الأولية الخاصة بها.

يتم اقتران كل جسم مضاد ثانوي مع مجسات PLA - خيوط الحمض النووي ذات التسلسلات التكميلية. ترتبط الأجسام المضادة الثانوية بالأجسام المضادة الأولية المرفقة مسبقا ، مما يجعل مجالس جيش التحرير الشعبى الصينى قريبا.

قم بتطبيق المخزن المؤقت للربط الذي يحتوي على قليل النوكليوتيدات الموصل - والتي تهجن مع مجسات PLA - ويقوم إنزيم الليغاز بسد الفجوة ، مما ينتج عنه DNA دائريا. احتضان الشريحة بمحلول تضخيم يحتوي على بوليميراز الحمض النووي و dNTPs ومجسات الكاشف المتصلة بالفلوروفور الأحمر.

باستخدام الحمض النووي الدائري كقالب ، يبدأ البوليميراز تضخيما للدائرة المتدحرجة ، مما يولد العديد من النسخ من قالب الحمض النووي المتصل ببعضه البعض. يظل الحمض النووي المضخم مربوطا بمسبار جيش التحرير الشعبى الصينى ، مما يتيح توطين تفاعل البروتين والبروتين.

تتفاعل مجسات الكاشف ، التي تحمل قليل النوكليوتيدات القصيرة أحادية الشريطة ، مع المناطق التكميلية للحمض النووي المضخم ، وتشكل دوبلكس وتنقل إشارات مضان إلى مجمعات البروتين. صور الشريحة تحت المجهر الفلوري.

لاحظ وجود بقع حمراء مميزة داخل الخلية ، مما يشير إلى تفاعلات البروتين والبروتين الناجحة.

استخدم مخفف الجسم المضاد لتخفيف الأجسام المضادة الأولية. ضع 40 ميكرولترا من محلول الأجسام المضادة الأولية المخففة لكل مساحة 14 × 14 ملم على الشرائح. ضع الشرائح في غرفة رطبة ، واحتضانها طوال الليل عند 4 درجات مئوية.

في الصباح ، اغسل الشرائح مرتين لمدة 5 دقائق لكل منها 50 مل من 1x washbuffer A في درجة حرارة الغرفة في جرة كوبلين. اضبط جرة Coplin على شاكر مداري مضبوطة على 60 دورة في الدقيقة. ضع الشرائح على منشفة ورقية للسماح لمخزن الغسيل بالجريان من الشريحة ، وامسح الحواف برفق.

قم بإعداد محلول سعة 40 ميكرولتر يحتوي على مجسات زائد وناقص. أضف المحلول إلى كل مساحة 14 × 14 ملم. احتضان الشرائح في غرفة رطبة لمدة 1 ساعة عند 37 درجة مئوية. اغسل الشرائح مرتين لمدة 5 دقائق لكل منها 50 مل من 1x washs buffer A في درجة حرارة الغرفة في وعاء كوبلين.

اضبط جرة Coplin على شاكر مداري مضبوطة على 60 دورة في الدقيقة. خفف عازلة الربط من 1 إلى 5 بالماء فائق النقاء. استخدم هذا المخزن المؤقت لتخفيف الليغاز من 1 إلى 40 لإعداد مخزون عامل من محلول الربط. ضع الشريحة على منشفة ورقية للسماح لمخزن الغسيل بالجريان من الجانبين ، وامسح الحواف برفق.

أضف 40 ميكرولترا من محلول الربط إلى كل مساحة 14 × 14 ملم. احتضان الشرائح في غرفة رطبة لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية. بعد غسل وتجفيف الشرائح كما هو موضح سابقا ، أضف 40 ميكرولترا من محلول التضخيم المحضر حديثا المحمي من الضوء إلى كل مساحة 14 × 14 ملم.

احتضن الشرائح في الغرفة المظلمة الرطبة لمدة 1 ساعة و 40 دقيقة عند 37 درجة مئوية. اغسل الشرائح مرتين لمدة 10 دقائق لكل منها 50 مل من 1x washs buffer B ، واغسل الشرائح مرة واحدة لمدة دقيقة واحدة باستخدام 50 مل من 0.01x washs buffer B.

بعد رسم محيط الشريحة المطلي بالإيبوكسي ، أضف 10 ميكرولتر من وسط التثبيت إلى كل عينة ، وقم بوضع غطاء برفق في الأعلى ، مما يسمح لوسط التثبيت بالانتشار. قم بالطلاء حول حافة الغطاء بطلاء الأظافر لإغلاق الغطاء والانزلاق. تجنب تحريك الغطاء. دع طلاء الأظافر يتماسك لمدة 20 دقيقة على الأقل في درجة حرارة الغرفة محمية من الضوء.