هضم البروتين على الغشاء لإعداد البروتينات المترسبة المناعية المشتركة لدراسات التفاعل

لإجراء الهضم على الغشاء ، خذ محلولا من مجمعات البروتين المترسبة المناعية المشتركة ، كل منها يحتوي على بروتين مستهدف مؤتلف يحمل علامة GFP المرتبط بالبروتين الشريك له.

انقل البروتينات إلى أنبوب يحتوي على ثنائي فلوريد البولي فينيلدين المبلل مسبقا ، وغشاء PVDF ، واحتضانه. يساعد السطح المحب للماء لغشاء PVDF على نقل البروتينات إلى الغشاء.

انقل الغشاء المحتوي على البروتين إلى أنبوب جديد. أضف عازلة تحتوي على عامل اختزال لتقليل روابط ثاني كبريتيد بين بقايا السيستين ، مما يؤدي إلى تمسخ البروتينات الفردية في المجمعات دون الإخلال بتفاعلها.

استبدل هذا المحلول بكاشف مؤلكل ، والذي يؤلكل مجموعة السلفهيدريل لكلا البروتينين في المجمعات ويمنع تكوين روابط ثاني كبريتيد. اغسل الغشاء لإزالة أي كاشف زائد.

عالج الغشاء بمحلول يحتوي على التربسين — وهو إنزيم محلل للبروتين. يشق التربسين البروتين المستهدف الموسومة ب GFP والبروتين الشريك له في محطة الكربوكسيل لبقايا الأرجينين والليسين ، مما يؤدي إلى إطلاق الببتيدات الأصغر في المادة الطافية. انقل المادة الطافية إلى أنبوب جديد.

اغسل الغشاء بمحلول حمضي ، وفصل أي ببتيدات مرتبطة عن الغشاء ، مما يضمن الاستخراج الكامل. اسحب الكسور المحتوية على الببتيد في أنبوب واحد. جفف عن طريق التجفيف بالمكنسة الكهربائية.

أعد تعليق البقايا بتركيز منخفض من حمض الفورميك ، وإذابة الببتيد