هضم البروتين على الغشاء لإعداد البروتينات المترسبة المناعية المشتركة لدراسات التفاعل

لإجراء الهضم على الغشاء ، خذ محلولا من مجمعات البروتين المترسبة المناعية المشتركة ، كل منها يحتوي على بروتين مستهدف مؤتلف يحمل علامة GFP المرتبط بالبروتين الشريك له.

انقل البروتينات إلى أنبوب يحتوي على ثنائي فلوريد البولي فينيلدين المبلل مسبقا ، وغشاء PVDF ، واحتضانه. يساعد السطح المحب للماء لغشاء PVDF على نقل البروتينات إلى الغشاء.

انقل الغشاء المحتوي على البروتين إلى أنبوب جديد. أضف عازلة تحتوي على عامل اختزال لتقليل روابط ثاني كبريتيد بين بقايا السيستين ، مما يؤدي إلى تمسخ البروتينات الفردية في المجمعات دون الإخلال بتفاعلها.

استبدل هذا المحلول بكاشف مؤلكل ، والذي يؤلكل مجموعة السلفهيدريل لكلا البروتينين في المجمعات ويمنع تكوين روابط ثاني كبريتيد. اغسل الغشاء لإزالة أي كاشف زائد.

عالج الغشاء بمحلول يحتوي على التربسين — وهو إنزيم محلل للبروتين. يشق التربسين البروتين المستهدف الموسومة ب GFP والبروتين الشريك له في محطة الكربوكسيل لبقايا الأرجينين والليسين ، مما يؤدي إلى إطلاق الببتيدات الأصغر في المادة الطافية. انقل المادة الطافية إلى أنبوب جديد.

اغسل الغشاء بمحلول حمضي ، وفصل أي ببتيدات مرتبطة عن الغشاء ، مما يضمن الاستخراج الكامل. اسحب الكسور المحتوية على الببتيد في أنبوب واحد. جفف عن طريق التجفيف بالمكنسة الكهربائية.

أعد تعليق البقايا بتركيز منخفض من حمض الفورميك ، وإذابة الببتيدات الجاهزة لتحديد تفاعل البروتين والبروتين.

لتحضير الغشاء ، قم بتقطيع أغشية PVDF إلى قطع 3 ملم × 3 ملم باستخدام مقص جراحي تم تنظيفه مباشرة قبل الاستخدام. ضع قطع الغشاء على ورق الألمنيوم ، وأضف 2 إلى 5 ميكرولتر من الإيثانول لكل قطعة. قبل أن تجف الأغشية تماما ، أضف 2 إلى 5 ميكرولتر من مادة البروتين المزلج إلى كل قطعة ، وجففها بالهواء حتى يصبح سطح الغشاء غير لامع.

ثم انقل الأغشية إلى أنابيب سعة 1.5 ملليلتر وقم بتخزينها عند 4 درجات مئوية. إذا كنت تستخدم على الفور ، أضف 2 إلى 30 ميكرولتر من الإيثانول ، مما يجعلها محبة للماء. قم بإزالة الإيثانول باستخدام ماصة. ولكن قبل أن تجف الأغشية ، أضف 200 ميكرولتر من محلول التفاعل القائم على DTT بالكامل إلى كل أنبوب ، واحتضنها عند 56 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة.

بعد الحضانة ، استبدل محلول التفاعل ب 300 ميكرولتر من محلول اليودوأسيتاميد ، واحتضنه في الظلام لمدة 45 دقيقة. ثم اغسل الأغشية مرتين بالماء المقطر ، ومرة واحدة باستخدام 2٪ أسيتونيتريل عن طريق الدوامة لمدة 10 ثوان على الأقل.

يمكن أن يكون العمل مع ثنائي ثيوثريتول والأسيتونيتريل خطيرا للغاية. يجب دائما ارتداء القناع والنظارات والقفازات عند إجراء عملية الهضم على الغشاء.

قم بإعداد التربسين وفقا لتوجيهات المخطوطة ، وأضف 100 ميكرولتر من محلول تفاعل التربسين إلى كل غشاء. احتضن طوال الليل عند 37 درجة مئوية للهضم.

في اليوم التالي ، انقل محلول التفاعل إلى أنبوب نظيف سعة 1.5 ملليلتر ، وأضف 100 ميكرولتر من المحاليل المغسولة إلى الغشاء. احتضان الغشاء عند 60 درجة مئوية لمدة ساعتين.

ثم اجمع المحلول المغسول واخلطه مع محلول التفاعل. أضف 100 ميكرولتر أخرى من المحلول المغسول إلى الغشاء ، وقم بصوتته لمدة 10 دقائق. ثم اجمع المحلول المغسول واخلطه مع محلول التفاعل. قم بتغطية أنبوب الاختبار بقطعة من فيلم المختبر ، وقم بعمل ثقوب صغيرة في الفيلم بإبرة.

جفف المحلول باستخدام مكثف فراغ ، وقم بإذابة البقايا في 10 ميكرولتر من حمض الفورميك 0.2٪. قم بالطرد المركزي للأنبوب عند 12,000 × جم لمدة ثلاث دقائق ، وانقل المادة الطافية إلى أنبوب عينة.

قم بتحليل العينة باستخدام مطياف الكتلة المرتبط بنظام nano-LC HPLC.