التحليل الطيفي لتذبذب التألق لدراسة تفاعل البروتين في ملامسات الخلية

يمكن دراسة تفاعلات الخلية الخلوية - بوساطة البروتينات في أسطح الخلايا المجاورة - في الخلايا الحية باستخدام مقايسة التحليل الطيفي لتذبذب التألق.

أولا، خذ مزارع خلايا منفصلة تعبر عن مستقبل الالتصاق — بروتين عبر الغشاء. يتم تصنيف المستقبل الموجود في الخلايا من المجموعتين ببروتينات فلورية مفصولة طيفيا. توجد ملصقات الفلورسنت هذه على المنطقة السيتوبلازمية للمستقبل ، مما يمنع التداخل مع تفاعل الخلية الخلية.

تخلص من الوسيط وأضف التربسين ، مما يسهل انفصال الخلية. امزج مجموعتي الخلايا واحتضان ، مما يسمح لمستقبلات الخلايا المجاورة بتكوين تفاعلات متجانسة.

ضع الخلايا تحت مجهر متحد البؤر. قم بإضاءة العينة باستخدام مصادر الليزر ذات الأطوال الموجية المناسبة ، مما يتسبب في انبعاث من كلا الملصقين الفلوريين. حدد موقع خليتين متجاورتين بإشارات مضان مختلفة الألوان على اتصال.

احصل على مسح خطي - عموديا على منطقة أغشية الخلايا الملامسة - باستخدام القناة الطيفية لكل من الملصقات الفلورية. يركز الليزر على حجم صغير من العينة - حجم الكشف. عندما تنتشر المستقبلات ذات العلامات الفلورية داخل وخارج حجم الكشف ، تتقلب شدة التألق.

إذا لم تتفاعل مستقبلات الخلايا المجاورة ، فإنها تتحرك بشكل فردي ، مما يؤدي إلى تقلبات مستقلة في شدة التألق مع ارتباط متقاطع منخفض.

إذا تفاعلت الخلايا المجاورة الملامسة عبر مستقبلاتها ، فإن البروتينات المتفاعلة تنتشر معا ، مما يتسبب في حدوث تذبذب مرتبط في شدة تألقها.

انقل محلول الخلية لبئر واحد إلى البئر المقابل. تخلط برفق عن طريق سحب العينة عدة مرات لأعلى ولأسفل ، ثم قم بزرع الخلايا المختلطة في طبق زجاجي سعة 35 مليلتر ، وقم بزراعة الخلايا المصنفة عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون ليوم واحد.

في برنامج المجهر متحد البؤر للمسح الضوئي بالليزر، قم بإعداد المسار البصري. لتجنب الحديث الطيفي ، حدد مسارين منفصلين لإثارة واكتشاف mEGFP أو mEYFP و mCherry أو mCardinal بالتتابع ، وحدد "تبديل مسارات كل خط". للكشف ، استخدم عوامل التصفية المناسبة لكلتا القناتين.

ضع الطبق الذي يحتوي على الخلايا المختلطة على حامل العينة. بعد الانتظار لمدة 10 دقائق لضمان توازن درجة الحرارة وتقليل انحراف التركيز البؤري ، ركز على الخلايا باستخدام ضوء الإرسال في قائمة "تحديد الموقع". ابحث عن زوج من الخلايا "الحمراء" و "الخضراء" على اتصال ببعضهما البعض.

بعد ذلك ، حدد مسار مسح عمودي على اتصال الخلية باستخدام زر "اقتصاص". "Zoom" لتحقيق حجم بكسل من 50 إلى 200 نانومتر وحدد "Line" في "وضع المسح الضوئي". اضبط "حجم الإطار" على 128 × 1 بكسل. اضبط "سرعة المسح" على الحد الأقصى للقيمة المسموح بها، ثم اضبط الدورات على 100,000 إلى 500,000.

بعد ذلك ، اختر قوى الليزر المناسبة. اضبط أجهزة الكشف على وضع "عد الفوتون". اضغط على "بدء التجربة" لبدء الاستحواذ.