مقايسة الترسيب المناعي لدراسة تفاعلات مستقبلات الإنزيم في الخلايا المنقولة

يحتوي

الموت المبرمج -1 ، PD-1 ، وهو بروتين مستقبلات سطح الخلية ، على شكلين من أشكال التيروزين السيتوبلازمية - الشكل المثبط ، TIM ، وفكرة التبديل ، ITSM. يحفز ارتباط الترابط فسفرة ITIM و ITSM وتجنيد بروتين فوسفاتيز التيروزين SHP2 في المجال السيتوبلازمي ل PD-1 ، مما يؤدي إلى سلسلة إشارات نهائية.

لدراسة تفاعلات SHP2-PD-1 عبر مقايسة الترسيب المناعي المشترك ، احصل على ثقافة الخلايا الظهارية الملتصقة. تعبر هذه الخلايا عن البروتين الفلوري الأخضر ، PD-1 من النوع البري الموسوم ب GFP مع ITIM و ITSM الفسفوري. احصل على الخلايا الظهارية التي تعبر عن PD-1 المتحور الذي يحمل علامة GFP ، حيث تمنع طفرات ITIM أو ITSM فسفرتها.

أضف محلول التحلل الذي يحتوي على منظف وأورثوفانادات الصوديوم. تعمل المنظفات على تحلل الخلايا ، مما يتسبب في إطلاق بروتين PD-1 الموسوم ب GFP. تطلق كتل أورثوفاناديت الصوديوم الفوسفاتيز ، وبالتالي تمنع إزالة الفسفرة ITIM و ITSM.

الطرد المركزي المحلل. انقل المادة الطافية المحتوية على البروتين إلى أنابيب جديدة. أضف حبات الاغاروز المغلفة بالأجسام المضادة المضادة ل GFP. ترتبط بروتينات PD-1 الموسومة ب GFP بالأجسام المضادة ل GFP.

احتضن مع تعليق SHP2. يربط PD-1-GFP المرتبط بالخرزة SHP2 عبر ITIM و ITSM الفسفوري.

أضف عازلة Laemmli واغليها بحيث تتسبب العوامل المختزلة والمنظفات الموجودة في الم