مقايسة الترسيب المناعي لدراسة تفاعلات مستقبلات الإنزيم في الخلايا المنقولة

الموت المبرمج -1 ، PD-1 ، وهو بروتين مستقبلات سطح الخلية ، على شكلين من أشكال التيروزين السيتوبلازمية - الشكل المثبط ، TIM ، وفكرة التبديل ، ITSM. يحفز ارتباط الترابط فسفرة ITIM و ITSM وتجنيد بروتين فوسفاتيز التيروزين SHP2 في المجال السيتوبلازمي ل PD-1 ، مما يؤدي إلى سلسلة إشارات نهائية.

لدراسة تفاعلات SHP2-PD-1 عبر مقايسة الترسيب المناعي المشترك ، احصل على ثقافة الخلايا الظهارية الملتصقة. تعبر هذه الخلايا عن البروتين الفلوري الأخضر ، PD-1 من النوع البري الموسوم ب GFP مع ITIM و ITSM الفسفوري. احصل على الخلايا الظهارية التي تعبر عن PD-1 المتحور الذي يحمل علامة GFP ، حيث تمنع طفرات ITIM أو ITSM فسفرتها.

أضف محلول التحلل الذي يحتوي على منظف وأورثوفانادات الصوديوم. تعمل المنظفات على تحلل الخلايا ، مما يتسبب في إطلاق بروتين PD-1 الموسوم ب GFP. تطلق كتل أورثوفاناديت الصوديوم الفوسفاتيز ، وبالتالي تمنع إزالة الفسفرة ITIM و ITSM.

الطرد المركزي المحلل. انقل المادة الطافية المحتوية على البروتين إلى أنابيب جديدة. أضف حبات الاغاروز المغلفة بالأجسام المضادة المضادة ل GFP. ترتبط بروتينات PD-1 الموسومة ب GFP بالأجسام المضادة ل GFP.

احتضن مع تعليق SHP2. يربط PD-1-GFP المرتبط بالخرزة SHP2 عبر ITIM و ITSM الفسفوري.

أضف عازلة Laemmli واغليها بحيث تتسبب العوامل المختزلة والمنظفات الموجودة في المخزن المؤقت على مجمعات البروتين PD-1-GFP-SHP2. جهاز طرد مركزي وجمع المادة الطافية التي تحتوي على مجمعات البروتين المشوهة. قم بإجراء SDS-PAGE واللطخة الغربية.

يتفاعل PD-1 من النوع البري والمتحور ITIM مع SHP2. تفشل طفرات ITSM في ربط SHP2 ، مما يشير إلى أن تفاعل PD1-SHP2 يتطلب ITSM مفسفرة.

أثناء إجراء الترسيب المناعي ، يجب تنفيذ جميع الخطوات إما على الجليد أو عند 4 درجات مئوية. استكمل المخزن المؤقت للتحلل بمثبطات الإنزيم البروتيني عن طريق إذابة قرص واحد من المثبطات في 10 مل من العازلة. أيضا ، أضف 1 ملليمولار من أورثوفانادات الصوديوم إلى المخزن المؤقت الذي سيتم استخدامه على ألواح PD1-GFP المنقولة. أضف 500 ميكرولتر من محلول التحلل المثلج البارد إلى الخلايا ، مع التأكد من إضافة المخزن المؤقت للتحلل الذي يحتوي على أورثوفانادات الصوديوم إلى الصفائح التي تحتوي فقط على خلايا PD1-GFP المنقولة.

استخدم مكشطة الخلية لإزالة الخلايا وجمعها على الفور من اللوحات. انقل المحللات إلى أنابيب باردة سعة 1.5 ملليلتر ، وقم بتدويرها عند 0.005 مرة جم و 4 درجات مئوية لمدة 30 دقيقة. لجمع المادة الطافية بعد النوى من المحللات ، قم بتدويرها عند 10,000 مرة جم و 4 درجات مئوية لمدة 10 دقائق.

انقل المواد الطافية إلى أنابيب جديدة وتخلص من الحبيبات. قم بتخزين المواد الطافية للمجموعة الثانية المكونة من ستة أطباق على الجليد ، لتحليل WCL لاحقا.

لبدء تحضير الخرز المضاد ل GFP ، رج الزجاجة التي تحتوي على الخرزات برفق قبل فتحها لمنع الاستقرار. قم بإزالة 40 ميكرولترا من الخرز المضاد ل GFP من الملاط لكل حالة. جهاز طرد مركزي عند 500 مرة جم و 4 درجات مئوية لمدة 3 دقائق. قم بإزالة المادة الطافية لغسل الخرز، مع التأكد من تقليل التلامس بين الماصة والخرز لمنع الخسارة.

أعد تعليق الخرزات في 80 ميكرولتر من محلول التحلل لكل عينة. أضف الخرزات المغسولة مباشرة إلى محللة الخلية من الخلايا التعبيرية عن PD1-GFP للمجموعة الأولى المكونة من أربع لوحات. قم بالتدوير عند 0.005 مرة جم لمدة 30 دقيقة عند 4 درجات مئوية لترسيب البروتينات التي تحمل علامة GFP المناعية. اغسل الخرزات ثلاث مرات باستخدام 1 مليلتر من محلول التحلل البارد الذي لا يحتوي على أورثوفاناديت لكل غسلة. ثم جهاز الطرد المركزي عند 2,500 مرة جم لمدة 10 ثوان.

قسم محللة SHP2 النشطة من المجموعة الأولى من الألواح إلى ثلاثة أجزاء متساوية ، وأضف جزءا إلى كل من الأنابيب الثلاثة التي تحتوي على الخرز المحتوي على PD1-GFP المغسول. أضف 1/3 من حجم المحللة من الخلايا غير المنقولة إلى الأنبوب الثاني من حبات PD1-GFP من النوع البري. تجاهل 2/3 المتبقية.

احتضان الخرزات لمدة 4 ساعات عند 4 درجات مئوية مع دوران لطيف عند 0.005 مرة جم. بعد ذلك ، اغسل الخرزات مرتين ، باستخدام 1 ملليلتر من محلول التحلل البارد لكل غسلة. أضف 80 ميكرولترا من المخزن المؤقت للتحلل إلى كل عينة ، مما يضمن أن الحجم الإجمالي في كل أنبوب هو 100 ميكرولتر. باستخدام طرف ماصة مقطوع، قم بتدوير الماصة برفق لأعلى ولأسفل للخلط. ثم انقل 50 ميكرولترا من كل أنبوب إلى أنبوبين جديدين سعة 1.5 مل.

أولا ، قم بتدوير الخرزات عند 2,000 مرة جم و 4 درجات مئوية لمدة 30 ثانية وقم بإزالة المادة الطافية. أضف 20 ميكرولترا من 2x Laemmli المؤقت ، واتركه يغلي على حرارة 95 درجة مئوية لمدة خمس دقائق. باستخدام مجموعة BCA ، قم بقياس تركيز البروتين لعناصر التحكم في الإدخال.

انقل 30 ميكرولترا من العينة المخففة إلى أنبوب جديد. استخدم المخزن المؤقت للتحلل لتخفيف بقية عناصر التحكم في الإدخال إلى نفس تركيز العينة الأكثر تخفيفا. بعد ذلك ، انقل 30 ميكرولترا من كل عنصر من عناصر التحكم في الإدخال المخفف إلى أنبوب جديد. أضف كميات متساوية من 2x Laemmli buffer إلى المحللات ، واغليها على حرارة 95 درجة مئوية لمدة خمس دقائق.

بعد ذلك ، قم بتدوير الخرزات عند 2,000 مرة جم و 4 درجات مئوية لمدة 30 ثانية قبل إجراء تحليل اللطخة الغربية كما هو موضح في بروتوكول النص.