موسوعة JoVE للتجارب
التقنيات البيولوجية
0 مشاهدة • 6:15 دقيقة • July 8th, 2025
في الخلايا ، ترتبط البروتينات ببروتيناتها المتفاعلة عبر تسلسلات محددة في بنيتها - مما يؤدي إلى تعديل عمل البروتين داخل الخلايا.
للكشف عن تفاعلات البروتين داخل الخلايا ، خذ مزرعة خلوية ملتصقة. استنشق الوسط.
أضف الببتيد المخترق للخلايا الحيوية ، ومحلول BCPP ، واحتضانه.
يحتويكل BCPP على تسلسل ببتيد يساعد في الارتباط المحدد بالبروتين داخل الخلايا المستهدف. يحتوي الببتيد على ببتيد مخترق للخلية ، CPP ، في الطرف N للببتيد والبيوتين في الطرف C لسهولة اكتشافه.
أثناء الحضانة ، تسهل منطقة CPP موجبة الشحنة دخول الببتيد المرتبط عبر غشاء الخلية ، والوصول إلى السيتوبلازم. يرتبط الببتيد بشريكه البروتيني المتفاعل داخل الخلايا - مكونا مركب بروتين مستهدف BCPP.
أضف عازلة تحتوي على جزيئات المنظفات التي تمزق غشاء الخلية وتطلق مجمعات البروتين المستهدفة BCPP والمكونات الخلوية الأخرى.
أضف محلولا من أفيدين المرتبط بحبة الاغاروز - وهو بروتين سكري يرتبط على وجه التحديد بالبيوتين في BCPPs. احتضان ، مما يسمح بارتباط أفيدين الذي لا رجعة فيه بالبيوتين وتنقية مجمعات البروتين المستهدفة من أفيدين-BCPP.
جهاز طرد مركزي لحبيبات الخرز. أعد تعليق الخرزات في مخزن مؤقت لشق الروابط غير التساهمية بين البروتينات ومجمعات بروتين الببتيد CPP من حبات البيوتين أفيدين.
تحليل مجمعات بروتين الببتيد CPP عن طريق النشاف الغربي. يشير نطاق الوزن الجزيئي الأعلى لمركب بروتين CPP-الببتيد من مكونات المركب إلى تفاعل ناجح بين شركاء البروتين المتفاعلين.
أضف حجم محلول مخزون BCPP إلى مزارع الخلايا للوصول إلى التركيز الذي ثبت فعاليته.
لذلك ، أضف 92.8 ميكرولتر من 2 ملليغرام لكل مليلتر من TAT-Connexin-43266-283-Biotin لكل مليلتر من وسط الاستزراع. ضع الخلايا في الحاضنة عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة 30 دقيقة ، للتأكد من حدوث التفاعلات بين BCPP وشركائها داخل الخلايا.
لإجراء استخراج البروتين ، أولا ، قم بشفط وسط الثقافة تماما. ثم اغسل الخلايا ب 10 ملليلتر من محلول ملحي مخزن بالفوسفات المثلج لكل 150 سم ، بحذر شديد لتجنب انفصال الخلايا.
للحصول على محللة الخلية ، أضف 3 ملليلتر من محلول التحلل لكل قارورة مساحتها 150 سنتيمترا مربعا ، واكشط السطح جيدا باستخدام مكشطة الخلية. سيسهل إمالة القارورة إلى حوالي 45 درجة جمع محللات الخلية في الأنابيب المقابلة لها.
صب 1 مليلتر من المحللة الخلوية لكل أنبوب في 3 أنابيب سعة 1.5 مليلتر مميزة لكل حالة. بالنسبة للسحب لأسفل ، قم بالطرد المركزي لأنابيب سعة 1.5 مليلتر عند 11,000 × جم لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية.
انقل المواد الطفية إلى أنابيب جديدة تحمل علامة A. انقل حصة من المادة الطافية لكل حالة إلى أنابيب مختلفة تحمل علامة B. ثم أضف 16.6 ميكرولتر من 4x Laemmli المؤقت ل 50 ميكرولترا من المحللة وقم بتجميدها عند 20 درجة مئوية تحت الصفر. بعد ذلك ، قم بتجانس NeutrAvidin agarose جيدا عن طريق الرج اللطيف.
قم بقص أطراف أطراف الماصة لزيادة قطرها وتحسين سحب الخرز. ثم أضف 50 ميكرولتر من NeutrAvidin agarose لكل مليلتر من محللة الخلية في الأنابيب A. احتضان تحلل الخلية عند 4 درجات مئوية بين عشية وضحاها مع هز لطيف جدا للسماح ل NeutrAvidin بالتفاعل مع BCPPs المرتبطة بشركائها داخل الخلايا.
ثم ، جهاز الطرد المركزي عند 3,000 مرة جم لمدة دقيقة واحدة عند 4٪ درجة مئوية لجمع مركب NeutrAvidin مع البروتينات. قم بإزالة المواد الطافية بعناية ، وانقلها إلى أنابيب نظيفة تحمل علامة C. احتفظ بها لاستخدامها في حالة عدم نجاح السحب لأسفل.
لغسل مركب NeutrAvidin بالبروتينات ، أضف عازلة التحلل الطازجة إلى حبيبات الأنابيب A. أعد تعليق الحبيبات عن طريق الانعكاس ، وكرر الطرد المركزي. كرر هذا الغسيل خمس مرات أخرى. يمكن التخلص من كل هذه المواد الطافية.
بعد ذلك ، أضف 40 ميكرولترا من 2x Laemmli المؤقت لكل أنبوب سعة 1.5 ملليلتر للكريات التي تم الحصول عليها من قوارير 150 سنتيمتر مربع من الخلايا المتقاربة. ثم قم بتقطيعه عند 100 درجة مئوية لمدة 5 دقائق لفصل التفاعلات بين البروتينات.
بعد الشطف, الطرد المركزي لمدة 30 ثانية في 8,200 مرات غرام إلى حبيبات NeutrAvidin الخرز. انقل المواد الطافية التي تحتوي على البروتينات المنفصلة ذات الأطراف الشعرية إلى أنابيب جديدة تحمل علامة D.
هذه المواد الطافية جاهزة الآن للتحميل في وصمة عار غربية كما هو موضح في بروتوكول النص ، أو يمكن تجميدها عند 20 درجة مئوية تحت الصفر.