مقايسة الخميرة ثنائية الهجين لتحديد الارتباط الذاتي للبروتين في خلايا الخميرة

بالنسبة لمقايسة الخميرة ثنائية الهجين ، خذ معلق خلية خميرة معدلة وراثيا ونشط النمو يفتقر إلى بروتين منشط النسخ ، GAL4. لا تستطيع هذه الخلايا تصنيع الليوسين والتربتوفان.

أضف زوجا من بلازميدات التعبير: أحدهما يشفر الليوسين ومجال ربط الحمض النووي ، DNA-BD ، من GAL4 ، مدمج في مجال البروتين المستهدف ، والآخر ترميز التربتوفان ومجال المنشط ، AD ، من GAL4 مدمج في مجال آخر من البروتين المستهدف.

أضف مخزن مؤقت يحتوي على عوامل مناسبة للتحويل. صدمة حرارية للخلايا لإحداث تكوين مسام عابرة ، مما يسهل امتصاص البلازميد الخلوي. تبرد لإعادة إغلاق المسام. ضع الخلايا على وسط نمو انتقائي يفتقر إلى الليوسين والتربتوفان.

تقوم الخلايا المحولة التي تعبر عن بروتينين هجينين بتصنيع الليوسين والتربتوفان ، والبقاء على قيد الحياة ، وتشكيل مستعمرات.

يرتبط DNA-BD المدمجة في مجال البروتين بتسلسل الحمض النووي الأولي المحدد لمنطقة محفز الجينات المشفرة β-galactosidase. إذا تفاعلت مجالات البروتين المستهدفة ، يقترب AD و DNA-BD ، مما يتسبب في إعادة تكوين GAL4 الوظيفي ، مما يؤدي إلى التعبير عن جين β-galactosidase.

انقل المستعمرات إلى ورق ترشيح. قم بتجميد الخلايا وإذابتها لتحللها وإطلاق β-galactosidase. ضع ورق الترشيح هذا فوق ورق ترشيح آخر مبلل بركيزة β-galactosidase.

يقوم β-galactosidase الذي تم إطلاقه بتحلل الركيزة إلى gal