مقايسة الخميرة ثنائية الهجين لتحديد الارتباط الذاتي للبروتين في خلايا الخميرة

بالنسبة لمقايسة الخميرة ثنائية الهجين ، خذ معلق خلية خميرة معدلة وراثيا ونشط النمو يفتقر إلى بروتين منشط النسخ ، GAL4. لا تستطيع هذه الخلايا تصنيع الليوسين والتربتوفان.

أضف زوجا من بلازميدات التعبير: أحدهما يشفر الليوسين ومجال ربط الحمض النووي ، DNA-BD ، من GAL4 ، مدمج في مجال البروتين المستهدف ، والآخر ترميز التربتوفان ومجال المنشط ، AD ، من GAL4 مدمج في مجال آخر من البروتين المستهدف.

أضف مخزن مؤقت يحتوي على عوامل مناسبة للتحويل. صدمة حرارية للخلايا لإحداث تكوين مسام عابرة ، مما يسهل امتصاص البلازميد الخلوي. تبرد لإعادة إغلاق المسام. ضع الخلايا على وسط نمو انتقائي يفتقر إلى الليوسين والتربتوفان.

تقوم الخلايا المحولة التي تعبر عن بروتينين هجينين بتصنيع الليوسين والتربتوفان ، والبقاء على قيد الحياة ، وتشكيل مستعمرات.

يرتبط DNA-BD المدمجة في مجال البروتين بتسلسل الحمض النووي الأولي المحدد لمنطقة محفز الجينات المشفرة β-galactosidase. إذا تفاعلت مجالات البروتين المستهدفة ، يقترب AD و DNA-BD ، مما يتسبب في إعادة تكوين GAL4 الوظيفي ، مما يؤدي إلى التعبير عن جين β-galactosidase.

انقل المستعمرات إلى ورق ترشيح. قم بتجميد الخلايا وإذابتها لتحللها وإطلاق β-galactosidase. ضع ورق الترشيح هذا فوق ورق ترشيح آخر مبلل بركيزة β-galactosidase.

يقوم β-galactosidase الذي تم إطلاقه بتحلل الركيزة إلى galactose ومنتج غير مستقر ، والذي يتأكسد ويتأكسد مكونا راسب أزرق على ورق الترشيح ، مما يشير إلى تفاعل مجال البروتين المستهدف.

في هذا الاختبار ثنائي الهجين للخميرة ، يتم استخدام خلايا الخميرة في منتصف مرحلة السجل للتحول. حصاد الخلايا عن طريق الطرد المركزي. أعد تعليق كل بيليه في خمسة ملليلتر من الماء المعقم ، وقم بتجميع معلقات الخلية. الطرد المركزي تعليق الخلية.

بعد التخلص من المادة الطافية ، قم بتعليق حبيبات الخميرة في ملليلتر واحد من أسيتات الليثيوم المعقمة 1X المحضرة حديثا و TE. يجب استخدام خلايا الخميرة المختصة في غضون ساعة واحدة من التحضير. قم بإعداد عينات البلازميد عن طريق خلط الطعم والهدف من الحمض النووي البلازميد مع 100 ميكروغرام من الحمض النووي الحامل لخصيتي الرنجة.

إلى كل أنبوب سعة 1.5 مليلتر ، أضف 100 ميكرولتر من تعليق الخميرة المختص و 600 ميكرولتر من أسيتات الليثيوم 1X ومحلول PEG ، والدوامة لمدة 30 ثانية تقريبا. احتضن على حرارة 30 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة مع الرج. أضف 80 ميكرولترا من ثنائي ميثيل سلفوكسيد ، واخلط جيدا عن طريق الانعكاس اللطيف.

صدمة حرارية لمدة 15 دقيقة في حمام مائي بدرجة حرارة 42 درجة مئوية أثناء الخلط كل دقيقتين إلى ثلاث دقائق. قم بتبريد تعليق الخلية على الجليد لمدة دقيقتين ، ثم جهاز الطرد المركزي لاستعادة الخميرة. أعد تعليق كل حبيبات خلية في 100 ميكرولتر من 1X TE. قم بوضع الخلايا على ألواح متوسطة SD مناسبة للحفاظ على الضغط الانتقائي على كل من الطعم والبلازميدات المستهدفة. احتضان الصفائح رأسا على عقب عند 30 درجة مئوية لمدة أربعة إلى خمسة أيام.

مستعمرات الخميرة جاهزة لهذا الاختبار عندما يبلغ قطرها حوالي ملليمترين. ماصة 2.5 مل من محلول Z-Buffer و X-Gal المحضر حديثا إلى لوحة نظيفة مقاس 100 مم وضع ورق ترشيح السليلوز في اللوحة. ضع ورقة ترشيح جديدة على سطح اللوحة مع محاوصة مستعمرات الخميرة. استخدم الملقط لفرك ورق الترشيح برفق على الطبق واتركه لمدة خمس دقائق تقريبا حتى تلتصق المستعمرات.

أثناء استخدام معدات الحماية الشخصية المناسبة ، ارفع ورق الترشيح بعناية واغمره في بركة من النيتروجين السائل لمدة 30 ثانية. دع ورق الترشيح المجمد يذوب في درجة حرارة الغرفة لمدة دقيقتين. ضع ورق الترشيح مع وضع جانب المستعمرة لأعلى فوق ورق الترشيح المنقوع مسبقا داخل اللوحة مقاس 100 ملم واحتضنه عند 30 درجة مئوية حتى تظهر مستعمرات زرقاء.